葫芦巴提取物激活Gβγ/PLC依赖途径促进GLP-1分泌并改善T2DM糖代谢

《Current Issues in Molecular Biology》：Trigonella foenum-graecum L. Extract Activates a Gβγ/PLC-Dependent Pathway to Promote GLP-1 Secretion and Improve Glucose Metabolism in T2DM

　　

目的：葫芦巴（Trigonella foenum-graecum L.）是一种传统上以水煎剂形式治疗糖尿病的特征性苦味草药。本研究旨在阐明葫芦巴水提物（FGE）的传统"苦味"特性是否通过靶向肠道苦味受体Tas2r138（人TAS2R38的小鼠功能性直系同源物）并调控GLP-1介导的肠-胰轴而发挥抗糖尿病作用。方法：以蒸馏水提取干燥葫芦巴种子并冻干。经绝对定量HPLC标准化后，将FGE以0.26和0.52 g/kg/天的剂量口服给予2型糖尿病（T2DM）小鼠四周。采用UPLC-MS/MS、网络药理学、分子动力学（MD）模拟以及STC-1肠内分泌细胞体外实验研究其潜在机制。结果：FGE显著降低T2DM模型的血糖水平，改善贪食、胰岛素抵抗和血脂异常，疗效与阳性对照二甲双胍相当。值得注意的是，FGE显著升高全身总GLP-1水平并恢复胰岛结构。机制上，FGE上调肠道Tas2r138表达并激活PLCβ2/TRPM5信号通路。HPLC定量鉴定葫芦巴碱（15.1 mg/g提取物）为主要苦味成分，其与人TAS2R38受体显示出良好的预测对接相互作用。在STC-1细胞中，葫芦巴碱直接刺激细胞内Ca²⁺流和GLP-1分泌，这些效应被Gβγ和PLC抑制剂显著减弱，提示涉及Gq偶联GPCR信号通路。结论：这些发现为葫芦巴在代谢紊乱中的传统应用提供了科学依据，证明FGE通过葫芦巴碱驱动的Gβγ/PLC依赖途径恢复糖脂稳态，这与调控肠道Tas2r138-GLP-1-胰腺胰岛素轴一致。

**研究背景与问题提出**

糖尿病（DM）是当前全球最紧迫的健康挑战之一，给全球医疗系统带来沉重社会经济负担。流行病学数据显示，中国拥有全球最大的糖尿病成人患者群体，亟需有效治疗策略。在所有糖尿病类型中，2型糖尿病（T2DM）约占90%–95%，以胰岛素抵抗（IR）和胰腺β细胞功能受损导致的慢性高血糖为特征。T2DM发病机制涉及遗传易感性、环境因素和代谢失调的复杂交互作用。当前临床管理主要依赖药物联合饮食和生活方式干预。

越来越多证据表明，胃肠道通过分泌肠内分泌激素发挥重要代谢调控器官功能。其中，胰高血糖素样肽-1（GLP-1）主要由回肠和结肠的肠内分泌L细胞分泌，在维持血糖稳态中发挥核心作用。GLP-1增强胰腺β细胞葡萄糖依赖性胰岛素分泌，促进β细胞增殖和存活，抑制胰高血糖素分泌。这些生理效应构成了GLP-1受体（GLP-1R）激动剂和二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂广泛临床用于T2DM治疗的基础。然而，GLP-1类似物的外源性注射性质及相关的持续性超生理GLP-1水平常引起不良胃肠道反应，如严重恶心和呕吐。因此，通过口服天然化合物刺激肠道营养传感器内源性释放GLP-1，成为一种极具前景且生理耐受性良好的替代治疗范式。

近年研究揭示，最初在口腔中发现的苦味受体（TAS2Rs）广泛表达于包括胃肠道在内的口外组织。在肠道中，TAS2Rs作为营养传感器调控激素分泌和代谢信号通路。这些受体属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族，触发味转导素介导的信号级联，诱导细胞内Ca²⁺释放，随后激活瞬时受体电位通道TRPM5并促进膜去极化，最终增强GLP-1分泌。在TAS2R家族成员中，人TAS2R38因其在胃肠道中的显著表达及与肠促胰岛素分泌的功能关联而备受关注。小鼠STC-1肠内分泌细胞系表达Tas2r138及其下游信号组分，为研究肠道肠促胰岛素分泌提供了可靠的体外模型。然而，天然苦味物质通过TAS2R38介导的肠-激素通路发挥抗糖尿病作用的潜力尚未被系统研究。

葫芦巴（Trigonella foenum-graecum L.，豆科）是一种传统药用草本植物，根据中国药典记载具有独特苦味和温性。现代药理学研究表明，葫芦巴提取物及生物活性化合物发挥多种有益代谢效应，包括改善IR和降低血糖水平。葫芦巴的多种成分，如葫芦巴碱、黄酮类和皂苷类，已被报道可保护胰岛并增强GLP-1分泌。然而，葫芦巴的特征性"苦味"是否作为直接药理信号激活肠道苦味信号并随后调控肠-胰轴，仍是一个重要科学问题。

本研究旨在鉴定葫芦巴提取物（FGE）的生物活性成分并系统阐明其在T2DM中的药理机制。研究人员结合糖尿病小鼠模型和STC-1细胞，研究FGE是否通过激活肠道苦味受体信号调控糖代谢。通过整合药理学实验、超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）化学谱分析和计算模拟，研究人员探索了FGE治疗效应背后的肠道Tas2r138-GLP-1-胰腺胰岛素信号轴。研究人员假设FGE通过激活肠道苦味信号改善糖代谢，从而刺激内源性GLP-1分泌并增强胰腺胰岛素释放以恢复代谢稳态。

**关键技术方法概述**

研究人员采用高脂饮食联合多低剂量链脲佐菌素（STZ）注射诱导T2DM小鼠模型（C57BL/6J雄性小鼠，来源：北京斯贝福生物技术有限公司），FGE灌胃给药4周。体外采用STC-1肠内分泌细胞系（来源：北京北纳创联生物技术研究院）进行机制验证。主要技术方法包括：UPLC-MS/MS化学谱分析鉴定FGE来源成分；绝对定量HPLC测定葫芦巴碱含量；网络药理学分析（TCMSP、SwissTargetPrediction、PharmMapper数据库及GSE25724数据集）；AlphaFold2预测TAS2R38三维结构；AutoDock Vina分子对接；GROMACS分子动力学模拟；RT-qPCR和Western blot检测基因和蛋白表达；ELISA测定GLP-1和胰岛素水平；免疫荧光分析胰腺组织GLP-1/GLP-1R表达；HE和PAS染色进行组织病理学评估。

**研究结果**

**3.1 FGE改善T2DM小鼠全身代谢紊乱**

通过4周治疗期动态代谢监测，T2DM模型小鼠表现出显著升高的每日能量摄入和进行性体重丢失。FGE和二甲双胍均有效抑制贪食，使能量消耗恢复至接近正常水平并维持稳定体重轨迹。T2DM模型表现显著升高的空腹血糖（FBG）和随机血糖（RBG）及代偿性高胰岛素血症。FGE给药及阳性对照二甲双胍显著降低FBG和RBG水平并成功缓解高胰岛素血症。OGTT结果显示FGE和二甲双胍治疗改善葡萄糖清除率（降低AUC值）并显著减轻全身胰岛素抵抗（降低HOMA-IR指数）。T2DM小鼠血清TG和TC水平显著升高，FGE或二甲双胍治疗后显著降低，TyG指数同样显著下降。安全性评估显示FGE和二甲双胍减轻肝脏脂滴积累、改善肾小球形态学改变、降低肾小球硬化评分，且未对肝肾功能指标产生不良影响。

**3.2 FGE增强GLP-1分泌并恢复组织形态**

T2DM模型组血清和回肠组织GLP-1浓度显著低于对照组，FGE和二甲双胍给药后全身循环和回肠组织GLP-1水平大幅升高。免疫荧光分析证实FGE和二甲双胍治疗后胰腺组织GLP-1和GLP-1R表达显著上调。FGE和二甲双胍显著保护肠道完整性，表现为恢复的绒毛结构和定量增加的绒毛长度。胰腺组织学显示T2DM小鼠胰岛结构破坏且体积缩小，而FGE和二甲双胍治疗显著改善整体胰岛形态并显著增加胰岛面积。

**3.3 FGE通过经典GLP-1R/PI3K-AKT轴增强胰腺胰岛素信号**

网络药理学分析鉴定FGE putative靶点与T2DM相关基因的交集，GO和KEGG通路富集分析显示这些靶点显著富集于多个核心通路，其中PI3K-AKT信号级联为突出候选。RT-qPCR分析证实胰岛素分泌和细胞存活相关基因（Pdx1、Irs1、Irs2、Insr和Ins）在T2DM小鼠中显著下调，FGE和二甲双胍治疗后大幅上调。Western blot显示FGE和二甲双胍显著增加PI3K蛋白水平和p-AKT/Total AKT比值，同时抑制GSK3β表达。这些发现表明FGE诱导的全身GLP-1升高功能性参与胰腺GLP-1R，协调下游胰岛素信号和β细胞保护。

**3.4 FGE激活肠道Tas2r138介导的苦味信号级联**

生理条件下Tas2r138 mRNA表达在结肠和回肠最为显著。T2DM诱导Tas2r138显著下调，FGE治疗有效恢复其表达（尤其在回肠）。RT-qPCR显示苦味信号机制基因（Tas2r138、Gnat3、Plcb2、Itpr3和Trpm5）在T2DM模型组显著下调，FGE治疗后显著上调。Western blot证实FGE给药后TAS2R138、GNAT3和PLCβ2蛋白水平显著升高。值得注意的是，阳性对照二甲双胍虽有效改善下游全身代谢参数，但未能显著上调肠道苦味信号组分表达。这一关键区别突出表明，二甲双胍主要通过经典全身代谢通路发挥作用，而FGE特异性靶向并激活肠黏膜内TAS2R38介导的苦味级联以发挥其独特治疗效应。

**3.5 葫芦巴碱的生物活性鉴定与机制验证**

UPLC-MS/MS分析鉴定回肠组织中多种FGE来源成分，包括葫芦巴碱、荭草苷、异荭草苷、异牡荆苷和薯蓣皂苷。绝对定量HPLC显示冻干FGE粉末中葫芦巴碱含量为15.1 mg/g。分子对接显示这些化合物（包括葫芦巴碱）对TAS2R38受体表现出良好预测对接相互作用，对接分数低于?6.0 kcal/mol。经典TAS2R38激动剂苯硫脲（PTC）作为阳性验证对照，对接分数为?6.2 kcal/mol，葫芦巴碱对接分数与该已知活性配体相当。MD模拟结果表明TAS2R38与葫芦巴碱形成稳定复合物。STC-1细胞经葫芦巴碱处理后显著刺激GLP-1分泌和增加细胞内Ca²⁺流，并上调Tas2r138、Gnat3、Plcb2、Itpr3和Trpm5转录。葫芦巴碱诱导的激素分泌和信号激活被PLC抑制剂U73122或Gβγ抑制剂Gallein显著减弱。这些发现机制性证实葫芦巴碱通过Gβγ/PLC依赖途径促进GLP-1分泌，与Gq偶联受体激活一致。

**3.6 FGE治疗T2DM的拟定机制**

综合数据阐明FGE改善T2DM的新型"肠道中心"机制：FGE及其生物活性成分葫芦巴碱激活与肠道Tas2r138受体一致的Gβγ/PLC依赖信号级联，触发PLCβ2/TRPM5信号通路刺激内源性GLP-1释放。升高的循环GLP-1随后参与胰腺GLP-1R，激活PI3K-AKT-GSK3β轴增强胰岛素分泌并保护β细胞形态，最终恢复全身血糖稳态。

**讨论与结论**

讨论部分指出，高脂饮食联合低剂量STZ广泛用于建立忠实模拟T2DM代谢特征的实验模型。本研究T2DM模型表现 pronounced 糖脂代谢紊乱。葫芦巴作为具有公认抗糖尿病特性的传统草药，此前已被报道可改善血糖控制。基于体表面积归一化方法，本研究中FGE剂量（0.26 g/kg）换算为人等效剂量约为0.021 g/kg，对于标准70 kg成人相当于每日约1.48 g冻干提取物，考虑20%提取率对应约7.4 g原始葫芦巴种子，恰好落在《中国药典》规定的标准临床推荐剂量（每日5–10 g）范围内。

近期新兴证据突出表达于口外组织（ particularly 胃肠道）的味觉受体的生理功能。肠道苦味受体激活已被证明可调控肠内分泌激素分泌，尤其是对血糖稳态至关重要的GLP-1。本研究中FGE治疗显著升高血清和回肠组织GLP-1水平，提示肠道作为FGE介导代谢调控的主要靶器官。在苦味受体家族中，TAS2R38在胃肠道广泛表达且研究深入，其功能与糖尿病进展和GLP-1分泌相关。有趣的是，糖尿病条件下本模型中Tas2r138表达显著降低，这一下调可能与近期病理生理学发现一致——包括TAS2R38在内的肠道味觉受体在严重肥胖和代谢综合征患者中显著下调，且这种下降与局部炎症标志物如IL-6呈负相关。因此选择回肠作为后续机制研究的主要部位。

GLP-1从肠道L细胞的分泌是介导肠-胰通讯的核心，构成调控代谢稳态的基础"肠-胰轴"。释放入循环后，GLP-1结合胰腺β细胞和其他器官广泛表达的GLP-1R，促进胰岛素分泌、细胞增殖和β细胞存活。关键的是，除直接胰腺效应外，GLP-1是强效厌食激素，中枢性抑制食欲、延迟胃排空并促进饱腹感。本研究的宏观表型数据与这一内分泌机制一致：FGE触发的强效内源性GLP-1释放功能性转化为T2DM小鼠严重贪食的显著减少和体重丢失的稳定。机制上，升高的GLP-1中枢性抑制食欲和延迟胃排空导致热量摄入减少，同时通过改善全身胰岛素抵抗和增强细胞葡萄糖摄取，FGE阻止未控制糖尿病特征的严重分解代谢组织分解。因此小鼠进食减少但体重稳定，因为细胞能量利用恢复。

葫芦巴化学成分高度复杂多样。研究人员此前已系统表征FGE化学成分。虽然葫芦巴含有多种降糖成分，但负责激活肠道味觉受体的特定苦味配体仍不明确。本研究进一步检测FGE给药后回肠组织中可检测化合物，发现多种代表性成分存在。值得注意的是，葫芦巴碱是《中国药典》中葫芦巴的特征性质量控制标志物，具有 documented 降糖活性，包括改善HepG2细胞IR。此外，葫芦巴碱是咖啡苦味特征的知名贡献者。这些属性使葫芦巴碱成为极 plausible 的天然配体。

本研究采用刻意的跨物种方法。体内糖尿病小鼠和体外STC-1肠内分泌细胞实验稳健研究小鼠直系同源物（Tas2r138/TAS2R138）以建立生理学概念验证，而计算分子对接和MD模拟则有意使用人TAS2R38受体，旨在桥接临床前模型与人类临床相关性。小鼠TAS2R138和人TAS2R38直系同源物共享约70%序列同源性，其跨膜配体结合域结构高度保守。

局限性方面，研究人员承认：Gβγ抑制剂Gallein和PLC抑制剂U73122靶向多个Gq偶联GPCR共享的下游信号节点，缺乏特异性Tas2r138基因敲低/敲除模型或高度特异性受体拮抗剂，无法 definitive 确立TAS2R138为唯一靶点；计算对接模型作为预测性结构假设不能替代实验受体结合测定；需要严格的胰岛素/胰高血糖素共染色和盲法形态计量学 definitive 量化绝对β细胞质量变化；肠-胰通讯仍 fundamentally 为相关性，未来需使用特异性GLP-1R拮抗剂（如Exendin 9-39）或GLP-1R敲除小鼠模型进行药理阻断实验以 definitive 证明FGE的胰岛保护效应完全依赖于肠道GLP-1释放。

结论部分翻译：总之，本研究提供药理学证据支持FGE在T2DM管理中的传统医学应用。研究结果阐明一种新型"肠道中心"药理学范式，即FGE由其苦味成分葫芦巴碱驱动，主要通过激活Gβγ/PLC依赖信号级联恢复糖脂稳态，这与肠道Tas2r138介导的苦味信号级联的参与高度一致。这种局部受体激活触发内源性GLP-1释放，随后通过PI3K-AKT-GSK3β通路参与肠-胰轴增强胰腺β细胞存活和胰岛素分泌。总之，这项综合研究为传统苦味草药抗糖尿病机制提供了深刻分子见解，确立了口外苦味受体的生理刺激作为代谢疾病干预的可行、安全且可口服的策略。