绿海龟未孵化卵中分离的弗氏柠檬酸杆菌与阴沟肠杆菌的预测代谢潜力：一项基因组规模的延伸研究

《Genes》：Predicted Metabolic Potential of Citrobacter farmeri and Enterobacter cloacae from Unhatched Chelonia mydas Eggs: A Genome-Scale Extension

　　

： 背景/目的： 弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter farmeri）和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）是从未孵化的绿海龟（Chelonia mydas）卵中回收的机会性肠杆菌科（Enterobacteriaceae）成员，但其次级代谢产物和代谢潜力仍未明确。本研究考察了这两个分类单元各一株分离株之间的预测差异中，哪些为该分离株所特有，哪些与同种公共基因组共有。方法： 对两株分离株的草稿基因组应用了antiSMASH v7.1.0、KofamScan/KEGG-Decoder模块分析（178个模块）并辅以BLASTP验证，以及经过整理的CarveMe v1.6.6基因组规模代谢模型。此外，还利用tblastn对18个公共基因组（9个C. farmeri；9个标注为E. cloacae，其中6个经平均核苷酸一致性（ANI）鉴定为与该分离株同种）进行了筛选，并统一构建了模型。结果： 两株分离株均携带肠菌素（enterobactin）基因簇；E. cloacae还携带气杆菌素（aerobactin）基因簇，而C. farmeri携带一个低置信度的高丝氨酸内酯合酶。178个模块中有14个存在差异，值得注意的是C. farmeri含有含c型细胞色素的细胞色素bc1复合体，而E. cloacae则含有Na+转运NADH：醌氧化还原酶（Na+-NQR）操纵子。模型预测的生物合成能力差异最大为9.1%。所有存在/缺失差异均在公共基因组中重现（bc1在9/9个C. farmeri和0/9个E. cloacae标注基因组中；Na+-NQR、pga和iucABCD在9/9个E. cloacae标注基因组和0/9个C. farmeri基因组中）；仅II型分泌系统簇存在变异（在1/9个E. cloacae标注基因组中缺失）。分离株间的模型化差异与同种基因组间的差异相符。结论： 这些差异是谱系水平特征，而非分离株特异性性状，且数据不支持其与龟卵生态位的关联；所有发现均为计算预测，需表型确认。

论文解读

研究背景与问题

海龟繁殖成功依赖于海滩沙巢中卵的成功孵化，这是一个封闭的微生物环境，细菌和真菌的定殖是胚胎死亡的一个反复出现且在某些情况下合理的促成因素。已有研究在哥斯达黎加绿海龟巢、意大利失败的红海龟巢以及格林纳达棱皮龟巢中，发现巢沙微生物群落组成与孵化成功率存在关联。在绿海龟巢中，未孵化卵内容物携带的机会性细菌负荷高于已孵化蛋壳或幼龟肠道，其中弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）和镰刀菌属（Fusarium）等被记录为卵病原体。这些研究确立了机会性肠杆菌科及相关革兰氏阴性菌是海龟巢和卵微生物组的常见成员。

本研究的对象——弗氏柠檬酸杆菌（C. farmeri）和阴沟肠杆菌（E. cloacae）——正是从土耳其Akyatan海滩不同巢穴的未孵化绿海龟卵中回收的两种此类机会菌。此前的研究已通过全基因组测序、KEGG注释和耐药组/毒力组筛选对其进行了表征，建立了共享核心基因组和附属基因差异，但次级代谢产物生物合成能力及细粒度代谢潜力仍未解决。本研究旨在回答：这两个共现分离株之间的预测差异，哪些是分离株特有的，哪些与同种其他成员共享。

研究内容与结论

研究人员对两株分离株的草稿基因组应用了三种互补的计算分析：antiSMASH v7.1.0预测次级代谢产物生物合成基因簇（BGC）、KofamScan/KEGG-Decoder模块完整性分析以及CarveMe v1.6.6基因组规模代谢模型重建与通量平衡分析（FBA）。此外，为检验分离株间差异是否具有谱系普遍性，还筛选了18个公共基因组（9个C. farmeri和9个标注为E. cloacae的基因组），并统一构建了代谢模型。

研究得出以下主要结论：两株分离株共享一个保守的代谢核心，但在铁获取、呼吸和表面互作的附属系统上存在差异，且这些差异均为谱系水平特征而非分离株特异性性状。数据不支持分离株水平的特化，也未建立与海龟卵生态位的直接关联。所有发现均为计算预测，需表型确认。

主要技术方法

研究人员采用了三种核心技术方法。其一为antiSMASH v7.1.0次级代谢产物生物合成基因簇预测，对两株分离株的组装重叠群进行BGC鉴定与产物类别分类。其二为KofamScan v1.3.0 KEGG直系同源（KO）分配与KEGG-Decoder v1.3模块完整性分析，评估178个KEGG模块的完整性，并对四个差异最大的基因集进行双向BLASTP验证。其三为CarveMe v1.6.6基因组规模代谢模型重建与COBRApy v0.32.1通量平衡分析，在M9和LB培养基上以革兰氏阴性BiGG反应宇宙为基础构建模型，并施加包括微量元素摄取上限、ATP维持和非元素/电荷守恒约束在内的整理约束集。样本来源为土耳其Akyatan海滩未孵化绿海龟卵中回收的两株分离株，以及18个从GenBank/RefSeq下载的公共基因组。

研究结果

预测的次级代谢产物生物合成基因簇。 antiSMASH分析在C. farmeri中鉴定出4个BGC区域，在E. cloacae中鉴定出5个。两株分离株均携带与肠菌素生物合成一致的NRP-金属载体/NRPS簇；E. cloacae还携带含串联IucA/IucC结构域和赖氨酸/鸟氨酸N-单加氧酶结构域的气杆菌素（iucABCD）簇，而C. farmeri未检出。反之，C. farmeri独有预测的N-酰基高丝氨酸内酯（hserlactone）合酶。两株均携带芳基多烯和硫肽簇，而羊毛硫肽II类簇仅见于E. cloacae。KnownClusterBlast比较显示，肠菌素/气杆菌素型铁载体区域和芳基多烯簇有显著参考簇支持，而hserlactone、硫肽和羊毛硫肽区域仅依赖基于规则的域检测。

KEGG模块完整性与预测的呼吸链差异。 178个KEGG模块中164个（92.1%）在两株间完整性分数相同。14个差异模块中，最显著的是末端呼吸链组分：C. farmeri携带三个连续基因编码细胞色素bc1复合体（K00411、K00412、K00413），而E. cloacae未检出bc1复合体KO；反之E. cloacae携带完整的六基因Na⁺-NQR操纵子（K00346-K00351，nqrA-F），而C. farmeri仅保留单个nqrC亚基。C. farmeri在钴胺素生物合成（0.88 vs 0.12）、NiFe氢化酶Hyd-1（0.66 vs 0.00）和硫代硫酸盐/多硫化物还原酶（0.33 vs 0.00）模块上完整性更高。E. cloacae则在PGA合成模块（1.00 vs 0.00）和II型分泌系统（T2SS）模块（0.85 vs 0.00）上更高。BLASTP验证确认bc1复合体缺失、Na⁺-NQR大部缺失和PGA缺失为真实缺失，但修正了T2SS：C. farmeri保留两基因GspF/GspE样直系同源对，而非完全缺失。

基因组规模代谢模型与预测的生物合成能力。 CarveMe重建产生规模相当的草稿模型，两模型在M9培养基上无需额外补加反应即可生长。完整性测试发现基线约束下存在能量生成循环和产率超限伪影，经整理约束修正后，碳自由ATP产生基本消除。FBA预测两株分离株对所有20种标准蛋白氨基酸均为原养型，25种产物中16种差异小于1%，最大差异为9.1%（吡哆醇）。两株均显示非零肠菌素合成通量。通量变异性分析显示替代最优通量分布存在，内部通量确定度差。阻断主末端氧化酶时，C. farmeri生长仅下降1.3%（可通过CYTBCYTC/CYTBMQOR2pp对重路由），而E. cloacae下降10.0%。

差异系统在同种公共基因组中的分布。 18个公共基因组中，9个C. farmeri组装体与分离株ANI为96.3–99.1%；9个标注E. cloacae中6个ANI为98.7–98.9%（同种），3个仅87.8–89.1%（属于复合群其他种）。所有存在/缺失差异均在公共基因组中重现：9/9个C. farmeri携带bc1簇、Ccm基因、c型细胞色素基因、四硫酸盐还原酶基因和高丝氨酸内酯合酶，均不携带Na⁺-NQR操纵子、pga基因、气杆菌素合成基因或完整T2SS簇；9/9个E. cloacae标注基因组（含3个其他种）携带完整六基因Na⁺-NQR操纵子、三个pga基因和iucABCD，均不携带bc1、Ccm、c型细胞色素或四硫酸盐还原酶。唯一种内变异是完整T2SS簇在1个同种E. cloacae基因组（CP073310.1）中缺失。统一构建的20个基因组模型中，两分类单元模型化范围在25种产物中24种重叠，仅色氨酸分离。

讨论总结

研究人员指出，预测的铁载体模式为两株分离株的生物合成潜力增加了通路特异性分辨率。共享的肠菌素簇与肠菌素作为肠杆菌科最广泛保守铁载体的地位一致，而E. cloacae额外的气杆菌素簇暗示更广的铁清除范围，但这是基于高毒力肺炎克雷伯菌的类比，并非本研究证据。bc1复合体与Na⁺-NQR的差异是最特异的基因组差异，且为谱系水平而非分离株特异性。两者并非可互换的替代：Na⁺-NQR作用于醌池入口，与两基因组均保留的NDH-1和NDH-2并行；bc1作用于醌池下游，需要仅C. farmeri编码的c型细胞色素伴侣。基因组规模模型对此解释支持有限，标准M9条件下两模型ATP产率相同、生长差异仅2–7%，且模型对呼吸差异的编码不忠实。C. farmeri的bc1复合体可能支持厌氧呼吸的假说被提出，但明确为待检验假说而非发现。C. farmeri的NiFe氢化酶Hyd-1和硫代硫酸盐/多硫化物还原酶模块仅部分完整，被解释为部分基因组潜力而非已证实的功能通路。E. cloacae更完整的PGA生物膜合成和T2SS与其表面定殖和胞外酶活能力一致，但本身不确立该能力。模型预测的近乎相同的核心生物合成能力被视为信息性阴性结果，并作为方法学警示：未整理的自动模型可产生表观基因组间差异。所有差异均为谱系水平特征，不能归因于海龟巢生态位，任何生态学解读仍为假说。

研究结论翻译

对先前测序的C. farmeri和E. cloacae分离株草稿基因组应用基于antiSMASH的生物合成基因簇预测、KEGG模块完整性分析和基因组规模代谢建模，并筛选18个公共基因组，表明分离株间的预测差异是两个谱系之间的差异而非分离株特异性性状，且叠加在共享代谢核心之上。E. cloacae除肠菌素外还携带气杆菌素簇、完整Na⁺-NQR操纵子但无细胞色素bc1复合体或c型细胞色素成熟机制、PGA生物膜合成和完整II型分泌簇；而C. farmeri保留bc1复合体及c型细胞色素、四硫酸盐还原酶和高丝氨酸内酯合酶。除II型分泌簇在9个E. cloacae标注基因组中1个缺失外，每个系统均存在于同属所有公共基因组中且不存在于另一属所有基因组中。基因组规模模型预测的核心生物合成能力在分离株间基本一致，差异≤9.1%。这些发现均为计算预测，需表型确认才能建立与海龟巢生态位的任何关联。