双链RNA（dsRNA）的多维调控功能：从基因表达调控、疾病发病机制到治疗潜力

《RNA Biology》：dsRNA: mechanisms of gene expression regulation, disease pathogenesis, and therapeutic potential

　　

双链RNA（dsRNA）长期以来被视为激活先天免疫的病毒病原相关分子模式。然而，dsRNA正日益被认识为参与RNA稳态、基因表达与细胞命运决定的调控性RNA种类。本综述讨论经典的dsRNA依赖性机制，包括RNA干扰（RNAi），尤其侧重核内RNAi，以及dsRNA感知网络，并结合更广泛的RNA-RNA双链相关调控过程。研究人员还探讨了结构上不同的RNA-DNA杂合体，这些结构在功能上与dsRNA应答性先天免疫通路趋同。进一步分析dsRNA产生、加工、感知与清除的失调如何参与肿瘤、自身免疫性疾病与神经退行性疾病的发生，以及如何对这些机制加以治疗性利用。总体而言，这些认识为理解dsRNA在生理调控、疾病发病机制与治疗应用中的作用建立了概念框架。

1. 1.
   引言。双链RNA（dsRNA）由两条互补RNA链经Watson-Crick碱基配对稳定形成，通常呈A型双螺旋构象。dsRNA最初主要被视为与病毒感染密切相关的病原相关分子模式（PAMP），但越来越多证据表明内源性dsRNA可在多种生理与病理条件下广泛产生，并在细胞应激或疾病状态下异常积聚。这些dsRNA不再被视为单纯的转录副产物，而是参与抗病毒免疫应答、肿瘤免疫、RNA稳态与细胞命运决定等过程的重要调控元件。dsRNA代谢失调或异常感知与多种人类疾病相关，包括Aicardi-Goutières综合征（AGS）与Singleton-Merten综合征（SMS）等罕见病。此外，一些结构上不同的局部RNA-RNA双链可来源于单条RNA分子内碱基配对或不同RNA间的分子间配对，并在功能上与经典dsRNA依赖性通路趋同。本综述系统总结dsRNA的内源性来源与结构特征，重点讨论RNAi、先天免疫感知及非经典dsRNA结合蛋白介导的基因表达调控，并进一步涉及局部RNA-RNA双链及源自R环的RNA-DNA杂合体，进而讨论dsRNA在肿瘤、自身免疫病与神经退行性疾病中的意义及基于dsRNA调控的治疗策略、挑战与前景。
2. 2.
   dsRNA的内源性来源与生物发生。2.1 表观遗传与表观转录组失调在dsRNA生物发生中的作用。2.1.1 转座元件表观遗传失调作为dsRNA来源。表观遗传失调诱导的转座元件（TE）激活是内源性dsRNA的主要来源之一。生理条件下TE主要经DNA甲基化介导的表观遗传抑制而沉默；DNA甲基化丢失或降低可去抑制特定TE类别，尤其是长散在核元件（LINE）与内源性逆转录病毒（ERV），产生互补的正 sense 与反义RNA，这些转录本可来自不同转录单元，并通过重叠互补区域退火形成dsRNA。短散在核元件（SINE）则主要通过反向Alu重复序列（IR-Alus）在同一转录本内发生分子内碱基配对，形成稳定茎环结构而产生免疫原性dsRNA。重复元件对dsRNA形成的贡献高度依赖物种特异性基因组景观：Alu元件为灵长类特异SINE家族，占人类基因组10%以上，是内源性免疫原性dsRNA的重要来源，但在其他哺乳动物谱系中不保守；啮齿类缺乏Alu元件，但含有独立扩张的B1与B2等SINE家族，可产生结构类似的dsRNA底物。RNAi还通过促进DNA甲基化依赖性沉默对TE活性提供额外表观遗传控制：Dicer将TE来源dsRNA加工为小干扰RNA（siRNA），后者招募DNA甲基转移酶（DNMT）建立并维持DNA甲基化依赖性TE沉默；Dicer功能受损时siRNA生成受阻，LINE-1等TE甲基化降低并转录上调。LINE-1的5′非翻译区（UTR）兼具正义与反义启动子活性，可产生部分互补转录本并退火形成dsRNA。异常组蛋白修饰亦影响TE激活：H3K9me3与H3K27me3等抑制性标记维持异染色质浓缩并抑制LINE-1与ERV转录，从而限制dsRNA产生；H3K4me2与H3K4me3等激活性标记促进染色质可及性并增强ERV及SINE家族中IR-Alus转录，驱动dsRNA生物发生；赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）选择性去除这些激活标记可维持TE沉默状态。

2.1.2 m⁶A丢失与表观转录组失调诱导的dsRNA形成。现有证据表明，N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰减少显著促进内源性dsRNA形成与积累。机制上，m⁶A在腺苷N⁶位引入甲基，削弱A-U碱基配对亲和力并使RNA双链失稳，从而抑制dsRNA形成；m⁶A缺失时该抑制解除，通常由YTHDF2等m⁶A阅读蛋白识别并降解的RNA转录本异常积累，尤其是来源于内含子区域与3′ UTR的转录本；这些转录本富含TE来源序列与反向重复序列（如Alu元件），更易通过互补碱基配对形成稳定dsRNA结构。

2.2 异常mRNA剪接诱导的dsRNA形成。mRNA剪接受损及异常保留内含子积累为内源性dsRNA形成提供结构基础。以I型蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）抑制剂MS023处理为例，PRMT1活性降低导致多种剪接因子（包括富含丝氨酸/精氨酸（SR）蛋白与snRNP相关蛋白）精氨酸甲基化不足，削弱剪接因子、其同源RNA底物与核心剪接体组分间相互作用，引发广泛内含子保留；富含IR-Alus的保留内含子序列易发生互补碱基配对，促进稳定dsRNA结构形成。基于该机制，剪接体靶向治疗（STT）成为肿瘤免疫治疗的有前景策略：三阴性乳腺癌中靶向SF3B1的剪接体抑制剂破坏剪接体功能，导致广泛内含子保留并促进dsRNA形成，异常积累的dsRNA激活RIG-I样受体（RLR）等dsRNA传感器，进而诱导I型干扰素（IFN-I）与炎症基因表达，重塑免疫微环境并增强抗肿瘤免疫应答。

2.3 环状RNA内的分子内dsRNA结构。环状RNA（circRNA）由前体mRNA经反向剪接生成的共价闭合RNA分子。多数circRNA中内含子IR-Alus促进形成稳定但部分不完美的dsRNA结构，通常长16–26个核苷酸（nt）。反向剪接因子NF90与NF110不仅促进转录本环化，还直接结合dsRNA结构以增强RNA双链稳定性。稳态条件下circRNA内dsRNA区域作为蛋白激酶R（PKR）双链RNA结合域（dsRBD）的高亲和力结合平台，维持免疫稳态；病毒感染时这些内部dsRNA结构被RNase L降解，PKR从circRNA结合抑制状态释放并激活PKR介导的免疫信号通路。

2.4 RNA聚合酶III转录RNA作为5′-ppp dsRNA内源性来源。RNA聚合酶III（Pol III）主要负责转录tRNA、5S rRNA、7SK snRNA、7SL RNA与Alu RNA等多种短非编码RNA（ncRNA）。其中7SL RNA与Alu RNA含广泛双链区域并保留5′-三磷酸（5′-ppp）末端，是dsRNA感知通路的潜在内源性配体。生理条件下这些双链区域被SRP9/14复合物遮蔽，5′-ppp末端被TDP-43屏蔽；TDP-43功能受损时7SL RNA与Alu RNA作为免疫刺激性dsRNA积累并暴露5′-ppp末端，增强免疫原性。近期研究表明，将7SL RNA病毒递送至嵌合抗原受体（CAR）T细胞可促进其扩增并向效应记忆表型分化，同时抑制T细胞耗竭，从而改善对实体瘤的抗肿瘤疗效并延长治疗持久性。

2.5 线粒体dsRNA生物发生。线粒体DNA（mtDNA）为环状双链基因组，从重链（H）与轻链（L）启动子双向转录，产生互补RNA转录本并退火形成线粒体dsRNA（mt-dsRNA）。生理条件下mt-dsRNA丰度受多核苷酸磷酸化酶（PNPase）、RNA解旋酶SUV3与线粒体poly(A)聚合酶（MTPAP）组成的监控复合物严格调控，维持轻链来源反义RNA低稳态水平，限制dsRNA形成。GRSF1与mtSSB等RNA加工因子失调及m⁵C RNA修饰缺陷亦参与mt-dsRNA生物发生调控；缺氧与电离辐射等外源性应激可进一步调节mt-dsRNA产生。mt-dsRNA积累超过临界阈值后，可经VDAC1/2、BAX/BAK复合物及PHB1/2等线粒体膜蛋白形成的孔道释放至胞质，作为新型损伤相关分子模式（DAMP）被RLR等胞质dsRNA传感器识别，触发IFN-I产生并参与先天免疫防御。

1. 3.
   dsRNA的结构特征与识别原则。3.1 dsRNA核心结构特征。经典dsRNA呈A型螺旋构象，具有宽而浅的小沟与窄而深的大沟，扩展的小沟为蛋白识别提供关键结构平台；核糖2′-羟基（2′-OH）在小沟内连续存在，形成特征性水化与氢键网络，稳定A型螺旋并增强dsRNA热稳定性。A型构象并非静态，离子条件与温度变化可改变大沟宽度与螺旋扭转角，影响dsRNA结构可及性。细胞内dsRNA在长度与结构背景上高度多样：经典长dsRNA包括病毒复制中间体及互补正义/反义转录本形成的延伸双链，短dsRNA包括Dicer切割产生的约21–25 nt siRNA。长度是dsRNA结合受体与蛋白选择性识别的重要决定因素，如MDA5偏好识别超过约500 bp的长dsRNA，而PKR可结合至少30 bp的dsRNA。除经典dsRNA外，局部RNA-RNA双链可由分子内碱基配对（如circRNA内不完美双链区域及含IR-Alu转录本）或不同RNA分子间配对形成，这些局部双链亦可作为dsRBP的直接底物。

3.2 dsRNA结合蛋白的结构特异性识别。由于A型螺旋结构，dsRNA窄而深的大沟限制直接序列特异性碱基识别，多数双链RNA结合蛋白（dsRBP）主要依赖dsRBD识别结构特征而非特定序列。机制上dsRBD区域1与2通常结合小沟内2′-OH，区域3与磷酸二酯骨架相互作用，共同赋予高度结构依赖性结合特异性，Dicer、AGO2与辅因子TRBP即为代表。序列特异性识别并非完全缺失：Dicer可特异性识别pre-miRNA双链区域切割位点附近的GYM基序（G-嘧啶-错配碱基），提高切割精确性与效率。dsRNA局部结构特征亦关键：末端可为平端或特征性2-nt 3′突出端，不同末端几何影响dsRBP锚定与定位，如Dicer利用2-nt 3′突出端准确定位并加工dsRNA底物；错配、凸起与发夹等非经典结构元件可改变大沟宽度并重塑蛋白识别表面，增强或减弱与不同dsRBP的结合亲和力，最终引导dsRNA进入RNAi或先天免疫激活等不同功能通路。

3.3 dsRNA结构修饰在自我/非我区分中的作用。细胞内dsRNA可携带多种结构修饰以促进自我与非我区分，主要包括ADAR1介导的腺苷至肌苷（A-to-I）编辑、5′-ppp与5′-二磷酸（5′-pp）等5′末端磷酸修饰及核糖-2′-O-甲基化（2′-O-Me）。A-to-I编辑作为宿主来源自我dsRNA的分子标签，有效阻止其被dsRNA传感器识别；5′-ppp与5′-pp末端是某些病毒dsRNA的特征，被宿主传感器识别为非我危险信号并触发抗病毒免疫应答；为避免异常识别，内源性宿主dsRNA经加帽与去磷酸化等加工减少5′-ppp暴露。核糖-2′-O-甲基化可减弱宿主对dsRNA的识别，抑制dsRNA传感器激活及下游基因调控信号；埃博拉病毒（EBOV）L蛋白具有内在2′-O-甲基转移酶活性，在病毒dsRNA 5′末端第一个核苷酸引入2′-O-Me修饰，使宿主传感器将病毒dsRNA误判为自我，促进免疫逃逸。

1. 4.
   dsRNA介导的基因表达调控机制。4.1 dsRNA通过RNA干扰调控基因表达。RNAi是由dsRNA启动的高度保守基因沉默机制。经典RNAi通路依赖Dicer将长dsRNA加工为约21–25 nt siRNA，后者装载至AGO2形成RNA诱导沉默复合物（RISC），介导互补mRNA靶标的序列特异性降解。除经典转录后沉默外，siRNA、AGO2与Dicer亦存在于哺乳动物细胞核内，挑战了关键RNAi因子局限于胞质的观点。特定实验系统中，核内siRNA-AGO2复合物识别启动子或染色质相关非编码RNA，靶向启动子相关ncRNA可招募DNMT1并诱导启动子DNA甲基化，亦与SETDB1等组蛋白甲基转移酶招募及特定位点H3K9me3富集相关，促进异染色质形成与核内基因转录沉默；siRNA-AGO2复合物亦可靶向启动子远端染色质相关RNA，如VINK等vlincRNA家族成员可在其对应启动子诱导转录沉默。核内RNAi效应不限于转录沉默：COX-2模型中siRNA-AGO2复合物结合启动子相关COX-2 RNA，促进RNA pol II及NF-κB、CREB1等转录因子招募，伴随H3K4me3与H4Ac等激活性组蛋白标记富集，促进COX-2转录激活。此外siRNA可靶向关键内含子-外显子连接处，干扰剪接因子招募并调节pre-mRNA剪接，产生不同mRNA异构体；RNAi与mRNA剪接可能存在相互影响，保留内含子的mRNA异构体可逃避RNAi依赖性降解。尽管如此，核内RNAi在哺乳动物内源基因表达调控中的生理意义仍待明确：与植物和真菌中内源性siRNA通路广泛指导DNA甲基化与异染色质形成相比，哺乳动物内源性核内RNAi机制的存在与生理相关性尚不充分；许多报道的核内RNAi效应基于外源siRNA系统或特定实验模型，未来需利用内源性dsRNA底物、生理相关模型与全基因组方法阐明其普遍性与生物学意义。

4.2 dsRNA感知在先天免疫基因表达中的作用。先天免疫系统通过识别微生物病原体及其他危险信号启动宿主防御。作为原型PAMP，dsRNA被多种先天免疫传感器系统识别：胞质中主要由RLR、PKR与2′-5′-寡腺苷酸合成酶（OAS）感知，内体dsRNA主要由Toll样受体3（TLR3）识别，共同启动先天免疫应答级联。这些传感器通路激活通过ISG转录诱导、广泛翻译抑制与靶向RNA降解等多机制重塑细胞基因表达程序。

4.2.1 RLR与TLR3介导dsRNA诱导的干扰素基因转录。RLR与TLR3构成细胞感知dsRNA并诱导干扰素基因表达的两条主要通路，分别代表胞质与内体监视机制。人RLR家族包括RIG-I、MDA5与LGP2，其中RIG-I与MDA5为主要胞质dsRNA传感器。RIG-I偏好识别带5′-ppp或5′-pp末端的短病毒dsRNA，这些结构特征通常在宿主内源RNA成熟加工中被消除；RIG-I虽可结合内源dsRNA，但其CARD结构域仅短暂暴露并被Hel2i结构域迅速重新封闭，防止持续信号传导与宿主自我dsRNA的不当激活。MDA5则以长度依赖方式强烈偏好长dsRNA双链，ATP水解使MDA5从短内源dsRNA解离，增强其对病毒复制相关长而稳定dsRNA结构的选择性。成功识别dsRNA后，RIG-I与MDA5构象改变暴露N端CARD，促进线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）激活及朊病毒样聚合；活化MAVS作为信号平台激活IRF3/7与NF-κB，共同诱导IFN-I（尤其IFN-β）及ISG15、MX1、RSAD2等广泛ISG转录，建立抗病毒状态。dsRNA免疫原性不仅取决于长度与末端修饰，还取决于高级构象状态：应激条件下部分dsRNA采用左手螺旋Z-RNA结构，被胞质Z-核酸传感器ZBP1经Zα2结构域识别，激活MAVS-TBK1-IRF3轴，诱导IFN-I与ISG。LGP2虽缺乏CARD，但作为RLR信号重要正调控因子促进RIG-I/MDA5-dsRNA复合物组装与信号活性，放大抗病毒应答。TLR3是人TLR家族中唯一专门识别长dsRNA（通常超过40 bp）的成员，主要定位于内体；虽在肥大细胞等某些细胞类型质膜上亦检测到TLR3表达，但膜相关TLR3是否具有功能性dsRNA感知与信号能力尚不明确。酸性内体环境中TLR3胞外域（ECD）结合dsRNA并发生配体诱导二聚化，触发TIR结构域构象改变；活化TLR3招募衔接蛋白TRIF，经TRAF6-NF-κB与TRAF3-IRF3通路诱导IFN-β及IL-6、IL-2、TNF-α等促炎细胞因子转录。当RIG-I与MDA5将ADAR1编辑不足的内源dsRNA误认为非我RNA时，IFN-I信号病理性激活，参与I型干扰素病，最显著者为AGS与SMS。由于RLR对dsRNA的区分依赖病毒与自我RNA间细微结构差异，维持抗病毒防御与防止不当自我识别间的平衡仍是理解干扰素相关疾病发病机制的核心挑战；相反，TLR3激活不足或失调可能与持续病毒感染相关。

4.2.2 dsRNA激活的PKR信号与翻译重编程。PKR主要以失活单体形式存在于胞质，经两个串联dsRBD（dsRBD1与dsRBD2）识别并结合至少30 bp的dsRNA，促进激酶结构域二聚化及Thr446与Thr451自磷酸化；在dsRBD2内α螺旋辅助下，PKR构象重排并完全激活。活化PKR磷酸化eIF2α，抑制翻译起始并导致广泛翻译抑制，有效抑制病毒蛋白合成与基因表达。在广泛翻译抑制背景下，部分宿主mRNA发生选择性翻译激活：整合应激反应（ISR）中ATF4翻译反而增强，触发eIF2α-ATF4-CHOP轴，促进促凋亡基因表达与细胞应激适应，限制病毒扩散。这表明PKR通路并非仅抑制整体翻译，而是通过抑制病毒蛋白合成并优先翻译细胞防御与修复相关基因，选择性重编程翻译输出。除翻译控制外，PKR亦作为信号枢纽，可磷酸化IκB与MKK6，激活NF-κB与p38 MAPK通路，诱导广泛炎症基因转录并促进IFN-β、IL-6等促炎细胞因子产生。值得注意的是，某些病毒已进化出对抗PKR激活的机制，部分情况下甚至利用活化PKR促进自身复制，如淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）。

4.2.3 dsRNA经OAS-RNase L轴介导RNA降解。人OAS家族以dsRNA长度依赖方式结合，其中OAS3对长dsRNA（>60 bp）偏好尤为明显，是激活核糖核酸酶L（RNase L）通路的主要dsRNA传感器。结合dsRNA后，OAS催化ATP聚合为2′-5′连接的寡腺苷酸（2-5A）；作为第二信使，2-5A促进RNase L二聚化与激活，介导细胞内RNA广泛降解，导致翻译停滞并抑制病毒复制。RNase L激活还诱导形成RNase L依赖性小体（RLB）等核糖核蛋白结构，促进亚基因组黄病毒RNA（sfRNA）隔离，阻止其与P-body组分互作，增强RNA降解效率。然而登革病毒（DENV）与寨卡病毒（ZIKV）可逃避RNase L介导的RNA降解；针对此类病毒反制，RNase L介导的mRNA核输出抑制成为广泛限制宿主与病毒基因表达程序的关键机制。

4.2.4 RLR、TLR3、PKR与OAS通路的整合性dsRNA感知。dsRNA触发的先天免疫应答并非由单一受体介导，而是由RLR、TLR3、PKR与OAS通路构成具有空间区隔、功能冗余与协同放大的整合感知网络。OAS-RNase L轴代表快速一线抗病毒通路，与其他dsRNA传感器在时间上互补：IRF2在未应激细胞中维持OAS3 mRNA基础表达，使感染早期RNase L快速激活，为后续RLR与PKR通路激活建立时间窗口；病毒感染后RLR与TLR3通路产生的IFN-β与IRF2协同促进STAT2磷酸化，诱导包括OAS3在内的ISG，在RLR/TLR3-OAS轴内建立正反馈环路。RLR与TLR3通路在dsRNA感知中具空间互补性，分别定位于胞质与内体，实现对病毒生命周期从进入到活跃复制的全面时空监视；二者分别经MAVS与TRIF信号汇聚于IRF3与NF-κB激活，协同诱导IFN-β与ISG，确保稳健抗病毒应答并降低单一通路受损导致免疫逃逸的可能。PKR作为RLR/TLR3-IFN-β轴中的关键信号整合者，在HCV感染中经dsRBD与MAVS和TRAF3结合，促进IFN-β产生；PKR激活还触发应激颗粒（SG）形成，作为PKR与RLR组分招募富集的支架平台，进一步放大RLR介导信号。总之，RLR、PKR、TLR3与OAS通路并非孤立信号模块，而是通过广泛信号串扰、功能冗余与协同放大相互连接，形成多层dsRNA感知网络。然而dsRNA感知并非仅具保护性且需严格调控，内源dsRNA异常积累可触发不当免疫激活、持续干扰素应答与炎症性疾病。此外，内源dsRNA基因组来源在物种间差异显著，如灵长类Alu元件与啮齿类B1/B2 SINE；跨物种互补研究表明小鼠ADAR1 p150与MDA5可功能性替代相应人蛋白，支持ADAR1介导内源dsRNA编辑与MDA5监视间调控关系的功能保守性，但TLR3、PKR与OAS等其他dsRNA感知机制是否对物种特异性内源dsRNA具类似跨物种功能保守性仍不清楚。

4.2.5 dsRNA应答性基因调控中的液-液相分离。新兴证据表明dsRNA传感器可发生液-液相分离（LLPS）形成动态生物分子凝聚体，通过浓缩信号组分并排除无关分子促进对dsRNA刺激的快速应答。例如dsRNA结合RLR后驱动下游衔接蛋白MAVS发生LLPS；电镜观察显示MAVS凝聚体由液滴样动态转变为高度稳定纤维状聚集体，有效招募IRF3与TBK1等关键信号分子，促进IRF3磷酸化并激活IFN-β转录。PKR亦为代表：dsRNA作为分子支架促进PKR组装为dsRNA诱导灶（dRIF）新型胞质凝聚体，选择性招募ADAR1与DHX9等抗病毒蛋白，降低PKR激活阈值并放大抗病毒信号。然而另一种观点认为PKR相关凝聚体形成未必增强下游信号：Zappa等报道PKR形成另一类动态簇，将活性PKR二聚体从胞质隔离并排除其底物eIF2α，从而缓冲下游信号、防止PKR通路过度激活。这些发现提示某些凝聚体可能作为信号缓冲器而非单纯放大应激应答；这些观察是否反映凝聚体组成、成熟状态或实验背景差异尚未解决，仅观察凝聚体形成不足以预测信号结果。

4.3 非经典dsRNA结合蛋白在dsRNA介导基因调控中的作用。除先天信号通路外，dsRNA还通过与非经典dsRBP互作调控基因表达。这些蛋白并非主要参与先天免疫信号转导，而在控制RNA命运与塑造细胞基因表达程序中起关键作用。

4.3.1 dsRNA-dsRBP互作介导的基因沉默。哺乳动物Vigilin（又称HDLBP）为含14个串联KH结构域的RNA结合蛋白，可特异性识别ADAR1介导A-to-I编辑产生的含肌苷dsRNA（I-dsRNA）；结合I-dsRNA后，Vigilin与ADAR1、DHX9及Ku70/80等辅因子形成多蛋白复合物，促进DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）激活；活化DNA-PK磷酸化下游效应因子KAP1，后者招募SETDB1与SUV39H1等组蛋白甲基转移酶，使靶染色质位点H3K9me3与H3K27me3等抑制性组蛋白标记积累，阻止RNA Pol II招募，实现转录基因沉默。Staufen蛋白（STAU1/2）识别并结合mRNA 3′ UTR内dsRNA结构，启动Staufen介导的mRNA降解（SMD）；靶标识别主要涉及mRNA自身分子内dsRNA结构，或mRNA 3′ UTR中Alu元件与富含Alu的lncRNA或mRNA间碱基配对形成的分子间dsRNA。结合这些dsRNA区域后，STAU1/2招募并促进ATP依赖性RNA解旋酶UPF1磷酸化；活化UPF1 ATP酶与解旋酶活性增强，导致mRNA脱帽并被5′→3′外切核酸酶降解，最终实现转录后基因沉默。

4.3.2 dsRNA-dsRBP互作维持细胞dsRNA稳态。RNA稳态不仅包括RNA丰度平衡，还包括细胞内dsRNA水平的动态调控。RNA解旋酶A（DHX9）是解旋酶超家族中典型dsRBP，利用串联dsRBD并协同ADAR1识别IR-Alus等内源逆转录元件来源dsRNA结构；经ATP依赖性DExH盒解旋酶活性解开dsRNA，限制异常dsRNA积累并维持细胞内dsRNA稳态。DHX9缺失时细胞内dsRNA显著积累，免疫相关基因（包括转录因子ATF3、IL-6与IL-2等促炎细胞因子及原癌基因JUN与FOS）强烈上调，最终导致细胞毒性增加与细胞死亡。值得注意的是，DHX9耗竭可诱导胞质dsRNA积累，激活肿瘤内在先天免疫，提示DHX9为增强抗肿瘤免疫应答的潜在治疗靶点。除dsRNA解旋酶外，RNA降解因子5′→3′外核糖核酸酶1（XRN1）经其5′→3′外核糖核酸酶活性降解内源逆转录元件来源dsRNA，参与dsRNA监视，防止异常积累并维持细胞稳态；XRN1功能受损时dsRNA稳态破坏，RIG-I与PKR等dsRNA感知通路异常激活并持续诱导ISG。总之，DHX9与XRN1作为细胞内dsRNA稳态的关键守护者，除防止dsRNA过度积累与不当先天免疫激活外，还维持RNA稳态并促进整体基因表达程序稳定性。

4.3.3 病毒dsRBP作为RNAi介导基因沉默的抑制因子。除宿主编码dsRBP外，许多病毒编码称为病毒RNAi抑制因子（VSR）的dsRNA结合蛋白，可拮抗宿主RNAi介导的基因沉默。在RNAi通路上游阶段，已实验验证多种哺乳动物VSR，包括诺达病毒B2蛋白（NoV B2）、甲型流感病毒非结构蛋白1（IAV NS1）、肠道病毒A71非结构蛋白3A（EV-A71 3A）与登革病毒2型非结构蛋白2A（DENV2 NS2A）；这些蛋白结合长dsRNA并阻断Dicer加工，阻止siRNA生成，使病毒逃避RNAi介导沉默。果蝇X病毒VP3（DXV VP3）等VSR亦通过dsRNA结合表现病毒RNAi抑制活性。在RNAi通路下游阶段，某些VSR（包括无脊椎动物虹彩病毒6 340R（IIV6 340R）与风疹病毒（RuV）衣壳蛋白）通过结合siRNA双链并阻止其装载至RISC抑制RNAi活性，损害靶病毒RNA切割。这些病毒dsRBP通过在RNAi通路多个阶段结构依赖性识别dsRNA或siRNA，建立病毒RNA沉默拮抗机制，为理解病毒RNA与宿主RNAi沉默机制间长期进化竞争提供重要证据。然而这些病毒拮抗机制的生物学意义在不同物种间差异显著：植物、节肢动物与线虫中细胞抗病毒防御主要依赖RNAi，VSR已进化为病毒拮抗该通路的重要因素；相反，一些研究提示RNAi对哺乳动物抗病毒防御贡献相对有限，dsRNA激活的干扰素介导先天免疫通路（包括RLR、PKR与OAS-RNase L信号轴）通常被认为是主要抗病毒防御机制。因此哺乳动物病毒感染中VSR是否主要通过拮抗宿主RNAi介导基因沉默促进病毒免疫逃逸，及其对病毒复制与宿主防御的实际贡献，仍需进一步研究。

4.4 RNA-RNA双链相关基因表达调控机制。除经典dsRNA依赖性通路外，调控性ncRNA与其靶标间互补配对形成的局部RNA-RNA双链亦可参与基因表达调控。

4.4.1 lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA调控网络在转录后调控中的作用。竞争性内源RNA（ceRNA）网络是研究最广泛的涉及miRNA与其靶转录本间局部RNA-RNA碱基配对的转录后基因调控机制之一。其核心原理在于不同lncRNA与circRNA可通过miRNA响应元件（MRE）竞争性结合共享miRNA，作为分子海绵减少游离miRNA池，从而减弱miRNA经3′ UTR结合介导的翻译抑制或AGO2依赖性mRNA降解对靶mRNA的抑制。ceRNA网络中单个lncRNA或circRNA可与多个miRNA互作，调节miRNA可用性并最终影响其对靶mRNA的调控效应。ceRNA网络内互作并非单向：结合miRNA的lncRNA自身可成为miRNA-AGO2复合物靶标，经去腺苷酸化、脱帽与外切核酸酶介导的RNA降解，建立双向调控关系；高度互补的ncRNA-miRNA配对可触发靶向miRNA降解（TDMD），涉及ZSWIM8 E3泛素连接酶复合物介导的AGO蛋白降解，最终导致miRNA失稳。此外部分lncRNA可绕过经典ceRNA机制，直接与靶mRNA 3′ UTR形成RNA-RNA双链干扰miRNA介导基因调控；如lncRNA PXN-AS1可与PXN mRNA 3′ UTR形成稳定RNA双链，阻断miR-24介导的mRNA降解，上调PXN mRNA表达。然而ceRNA介导调控是否为广泛生理机制仍存争议：尽管大量研究报道lncRNA与circRNA可经竞争性结合miRNA调控靶基因表达，定量分析表明ceRNA效应受miRNA丰度、结合亲和力、靶位点丰度及ceRNA、miRNA与靶转录本间化学计量关系强烈制约；Denzler等发现单个内源转录本对miRNA总有效靶丰度贡献极低，因此多数生理条件下单个ceRNA分子变化不太可能显著改变miRNA活性；但该调控模式在肿瘤等病理背景中可能更突出，lncRNA或circRNA异常高表达或转录组重塑可通过增加miRNA结合位点丰度增强ceRNA效应。总之，经典ceRNA调控依赖miRNA与不同靶RNA上MRE间碱基配对，仍需进一步定量与生理研究严格验证预测的ceRNA网络。

4.4.2 增强子RNA-启动子RNA双链在长程转录调控中的作用。近期研究表明增强子RNA（eRNA）可与启动子相关RNA（pRNA）形成RNA-RNA双链，调控启动子活性并促进靶基因表达。这些eRNA-pRNA互作由RNA结合蛋白二聚化促进，后者作为分子桥建立“RNA-蛋白-RNA”复合物，促进染色质环化并利于转录机器空间招募至特定基因座，实现长程转录调控。此外eRNA与pRNA（尤其上游反义RNA（uaRNA））可通过互补序列（尤其Alu元件）直接形成RNA-RNA双链，为增强子-启动子识别提供分子特异性；实验证据显示从增强子或启动子RNA中删除单个Alu序列显著削弱长程增强子-启动子互作并降低靶基因转录。这些发现表明eRNA-uaRNA配对形成的RNA双链并非单纯转录副产物，而主动参与长程顺式调控过程，为理解RNA-RNA双链形成如何促进基因表达空间组织与精确控制提供新视角。

4.4.3 saRNA经启动子靶向介导的RNA激活。RNA激活（RNAa）是小激活RNA（saRNA，通常为19 nt双链、带2-nt 3′突出端）靶向基因启动子诱导转录上调的生物学现象。RNAa具严格靶序列要求：saRNA通常避开CpG岛与Alu元件，其活性依赖saRNA 5′端修饰及靶启动子序列完整性与保守性。RNAa核心机制始于saRNA在dsRNA装载因子辅助下装载至AGO2，随后去除过客链生成引导链-AGO2复合物；核转位后该复合物利用引导链种子区（2–8 nt）经序列互补特异性识别靶基因启动子或启动子相关ncRNA，促进转录激活因子及相关调控因子招募，启动基因激活。该靶向过程伴随启动子区表观遗传重塑，特征为抑制性组蛋白标记（如H3K9me2）减少与激活性标记（如H3K4me2、H3K9ac）富集；这些染色质变化增强可及性、暴露转录起始位点（TSS）并促进RNA Pol II及相关因子招募至前起始复合物，驱动强效转录激活。此过程中PAF1复合物与RITA复合物等辅助因子协同促进RNAa介导的染色质重塑与转录延伸。与ceRNA网络及eRNA-pRNA互作一起，RNAa说明RNA-RNA双链在多层调控中调控基因表达的显著多样性，凸显RNA双链相关正性基因调控的独特机制。

4.5 R环来源RNA-DNA杂合体与dsRNA介导先天免疫信号的功能趋同。R环是真核细胞中一种三链核酸结构，由RNA-DNA杂合体与置换的单链DNA组成；其并非dsRNA，识别与代谢涉及部分不同蛋白系统，本综述讨论因其在特定条件下R环来源RNA-DNA杂合双链可与dsRNA介导先天免疫通路功能趋同。除经典dsRNA配体外，R环可通过产生免疫刺激性RNA-DNA杂合体激活先天免疫信号。BRCA1功能缺陷或RNA-DNA解旋酶SETX耗竭时，转录相关R环解析受损并异常积累；积累的R环可被XPF与XPG等结构特异性内切核酸酶加工，生成释放至胞质的RNA-DNA杂合体，但其如何被精确调控以被XPF/XPG识别切割及如何离开核尚不清楚。进入胞质后这些杂合体作为新型免疫原性物种，可被内体dsRNA传感器TLR3与胞质DNA传感器cGAS识别，促进IRF3磷酸化并诱导IFN-β与ISG表达，触发先天免疫应答。尽管TLR3经典上被视为dsRNA传感器，RNA-DNA杂合体激活TLR3信号提示这些结构具dsRNA样免疫刺激特性；因此异常加工的R环来源产物虽非经典dsRNA结构，但可通过部分重叠的先天免疫感知机制与诱导免疫相关基因表达，在功能上与dsRNA介导先天免疫通路趋同。近期研究进一步强调RNA结构稳态在调控此类免疫激活中的重要性：转录应激下MYC蛋白促进核RNA外泌体招募至富含R环与dsRNA相关结构区域，降解异常积累的免疫刺激性RNA；MYC RNA结合区III（RBRIII）功能丧失时外泌体招募受损，R环与dsRNA积累增加并激活肿瘤细胞TLR3-TBK1免疫通路。该研究还揭示RBRIII突变MYC保留限制dsRNA装载至TLR3的能力，但无法抑制RNA-DNA杂合体介导的TLR3激活，提示dsRNA与RNA-DNA杂合体虽可功能趋同于TLR3信号通路，但不同结构可能受不同上游机制调控。此外异常R环积累及后续先天免疫激活对疾病结局的影响可能因细胞环境而异：在神经退行性疾病共济失调伴眼动失用症2型（AOA2）患者来源细胞中，该机制可能促进细胞死亡并加剧神经元丢失；相反在早期肿瘤发生中，该机制可能通过清除BRCA1突变背景下基因组不稳定细胞发挥保护作用。因此R环诱导的免疫信号促进疾病发展还是作为保护屏障，仍是有待进一步研究的重要未解问题。

1. 5.
   dsRNA在疾病发病机制与进展中的作用。在不同疾病背景下，dsRNA失调可发生于其细胞生命周期多个阶段，包括产生、编辑、免疫感知与清除。这些改变可影响内源dsRNA丰度、结构特性或细胞内分布，以及dsRNA传感器应答阈值，导致RLR-MAVS、PKR-eIF2α与OAS-RNase L等dsRNA应答通路异常激活；由此产生的干扰素信号、蛋白翻译、RNA降解与细胞命运变化，为dsRNA介导调控与疾病发病及进展提供机制联系。

5.1 dsRNA与肿瘤。肿瘤微环境中癌细胞常发生广泛DNA低甲基化与异染色质丢失等肿瘤相关表观遗传重编程，解除TE表观遗传抑制并促进内源dsRNA产生。异常积累的dsRNA可被识别为病毒感染相关核酸信号，触发病毒模拟应答：dsRNA被RLR与TLR3等受体感知，诱导IFN-I应答与广泛ISG转录；同时PKR与OAS-RNase L通路激活分别抑制肿瘤细胞整体蛋白翻译并促进RNA降解，持续或过度激活时可进一步促进肿瘤细胞死亡。此外病毒模拟可诱导免疫原性细胞死亡（ICD），释放肿瘤抗原与DAMP，增强树突状细胞抗原呈递并促进CD8⁺ T细胞激活，将肿瘤内在dsRNA应答转化为适应性抗肿瘤免疫。相反肿瘤细胞已进化出多种策略对抗病毒模拟并实现免疫逃逸，包括MAVS等关键信号分子下调、ADAR1介导的反向重复元件（IRE）超编辑及ISG mRNA加工改变。此外肿瘤进展中RLR激活诱导的IFN-β与活化T细胞和NK细胞分泌的IFN-γ均可上调PD-L1表达，该反馈环路促进免疫抑制性肿瘤微环境建立，进一步利于免疫逃逸。近期研究表明肿瘤细胞可通过限制dsRNA前体胞质输出抑制病毒模拟：逆转录元件来源核RNA转录本需mRNA输出机器到达胞质，随后形成dsRNA并激活抗肿瘤免疫；但肿瘤细胞可异常调控CARM1增强RNA外泌体活性并抑制DDX39A与ALYREF等RNA输出因子表达，减少胞质dsRNA积累并减弱免疫激活。这些发现提示dsRNA介导的病毒模拟受核-胞质RNA运输通路严格调控。

5.2 dsRNA与自身免疫性疾病。先天免疫传感器对内源dsRNA的异常识别可破坏免疫稳态并驱动IFN-I信号持续激活。ADAR1缺陷与IFIH1（编码MDA5）功能获得（GOF）突变在不同调控层面破坏自我dsRNA耐受：ADAR1缺陷未必增加dsRNA总丰度，而是A-to-I编辑不足使内源dsRNA更具免疫原性并更易被MDA5识别；IFIH1 GOF突变增强MDA5对内源dsRNA的应答性，有效降低自我RNA识别阈值。尽管机制不同，两种缺陷均汇聚于MDA5-MAVS信号轴异常激活，导致IFN-I持续产生与ISG表达；该通路持续激活破坏免疫耐受并参与I型干扰素病发生。AGS为这类罕见干扰素病的原型，与ADAR1功能丧失（LOF）或IFIH1 GOF突变相关；遗传学证据表明这些突变在AGS患者中常互斥，虽影响dsRNA调控不同步骤，但最终均促进MDA5异常激活与IFN-I信号持续。除AGS外，Singleton-Merten综合征及银屑病、系统性红斑狼疮（SLE）与类风湿关节炎（RA）等更常见自身免疫病亦与dsRNA稳态或感知失调相关。

5.3 dsRNA与神经退行性疾病。神经系统对RNA稳态扰动尤为敏感，部分因神经元维持异常高的内源dsRNA基础水平。ELAVL家族蛋白神经元特异性表达显著延长mRNA 3′ UTR，增加dsRNA形成与积累，ADAR1敲除细胞中该现象更明显。这种升高的基础dsRNA水平被认为代表预适应抗病毒状态，使神经元能快速应答病毒感染，但也使神经元对病理性dsRNA积累尤为易感。ADAR1缺陷等条件下过度dsRNA积累可触发病理性炎症与神经元死亡，参与多种神经退行性疾病发生。肌萎缩侧索硬化（ALS）与额颞叶痴呆（FTD）患者中，积累的神经元dsRNA可诱导IFN-I应答、促进神经炎症并驱动神经元死亡。动物研究还将dsRNA积累与RNA结合蛋白TDP-43功能丧失联系起来。此外阿尔茨海默病（AD）与进行性核上性麻痹（PSP）患者脑组织中观察到dsRNA与MDA5水平升高及促炎信号增强证据。这些发现提示dsRNA介导免疫激活可能是多种神经退行性疾病神经炎症病理的共同贡献因素。

1. 6.
   基于dsRNA策略的治疗潜力。6.1 通过RNAi的dsRNA基因沉默治疗。dsRNA经RNAi介导的基因沉默已成为现代核酸治疗基石策略之一。合成siRNA装载至含AGO2的RISC复合物，引导链指导序列特异性识别……