香茅（Cymbopogon winterianus）精油纳米制剂对运输过程中大盖巨脂鲤（Colossoma macropomum）麻醉效率及抗氧化基因表达的调控作用

《Aquaculture Reports》：Nanoformulations of Cymbopogon winterianus essential oil modulate anesthetic efficiency and antioxidant gene expression in Colossoma macropomum during transport

　　

运输应激是水产养殖中的关键瓶颈，而常规缓解策略在有效性或安全性方面常存在局限。本研究评估了香茅（Cymbopogon winterianus）精油（EOCW）及其纳米制剂（NE-EOCW和PCLN-EOCW）的麻醉效力，以及对大盖巨脂鲤（Colossoma macropomum）抗氧化基因转录响应的影响。采用Tween 80和超声法制备纳米乳（NE-EOCW），通过溶剂蒸发法获得聚-ε-己内酯纳米粒（PCLN-EOCW）。EOCW经气相色谱-质谱联用分析表征，NE-EOCW和PCLN-EOCW则进行zeta电位、动态光散射和多分散指数（PDI）分析。此外，评估了PCLN-EOCW的包封率（EE）和载药量（LC）。实验1评估了160尾鱼种暴露于EOCW、NE-EOCW和PCLN-EOCW（25–150 mg L?1）的诱导时间和复苏时间。实验2采用定量PCR检测93份大盖巨脂鲤肝脏样本中抗氧化酶（cat和sod）的转录响应，取样时间为运输结束后即刻（IAT）、暴露于EOCW、NE-EOCW、PCLN-EOCW及其各自对照（含醇与无醇）后24 h和72 h。EOCW中鉴定出的主要化合物为香叶醇（28.79%）、香茅醛（24.33%）和香茅醇（16.49%）。NE-EOCW粒径稳定（126–167 nm）、胶体稳定（–25至–37 mV）、PDI在第3天为0.19、第90天为0.06；PCLN-EOCW在90天内粒径为194–208 nm、zeta电位为–16.8至–37.8 mV、PDI在第3天为0.12、第90天为0.16，第15天降至0.08，EE为81.9%、LC为96.1%。EOCW、NE-EOCW和PCLN-EOCW的诱导时间分别为35–127 s、37–404 s和33–388 s，复苏时间分别为167–287 s、127–255 s和143–285 s。值得注意的是，在长时间运输（24 h）中，NE-EOCW（10 mg L?1）在暴露72 h时降低cat和sod的mRNA水平，而含醇对照在相同条件下提高转录水平。综上，这些纳米制剂在不损害水质的前提下提高了麻醉效率并调控氧化应激的转录响应，支持其作为热带水产养殖可持续纳米技术工具的潜在应用。

研究背景方面，鱼类运输是水产养殖生产系统中的关键环节，直接影响动物福利、存活率和生产性能。然而运输过程中鱼类被长时间限制在封闭系统中，承受显著应激，氮代谢产物累积逐渐恶化水质，进而影响鱼类应激等多项生理过程。缓解运输应激的替代方案之一是使用植物精油类天然麻醉剂，其不仅可为运输、生物测量、繁殖等操作提供镇静，还可改善水生生物运输期间的生理状态和水质。同时，确定适宜的麻醉剂量是防止水产养殖物种操作过程中机械与生理损伤的关键步骤。水产养殖用麻醉活性成分应具备1–3 min的诱导时间和低于5 min的复苏时间，且成本低、水溶性好、无副作用。植物精油（EO）是一类高浓度挥发性有机化合物，主要由酚类、酯类、单萜类、醛类和酮类组成。其中香茅（Cymbopogon winterianus，爪哇香茅）精油含香叶醇和香茅醛等活性化合物，具有抗氧化、抗真菌、抗菌、驱避和镇痛等多种生物效应，作为鱼类麻醉镇静剂潜力较高，包括对大盖巨脂鲤。已有研究提出使用负载精油（EO）的纳米乳和纳米粒以提高乳液均一性和比表面积，可能增强生物活性物质效力，从而降低所需EO浓度并减轻其潜在应激相关副作用。纳米乳是由油滴分散于水相并由表面活性剂稳定的胶体系统，水中分散性高、生物活性化合物释放快，但稳定性中等，随时间可能发生聚结。负载EO的纳米粒由固体基质构成，通常为聚合物或脂质材料，活性化合物被包封其中。聚己内酯（PCL）是常用聚合物之一，因其低炎症潜能和低血管化率而广泛用于生物医学，与壳聚糖或聚乳酸（PLA）等可生物降解聚合物不同，PCL熔点低、降解更慢，可使活性成分在基质中保留更长时间；此类系统往往具有更高物理稳定性、更好保护EO免受挥发和降解，并实现生物活性化合物的更可控释放。目前利用负载EO的纳米乳和纳米粒降低水生生物应激是新兴且发展不足的领域，鲜有研究在相同实验条件下对同一物种比较同一EO的两种纳米制剂。已有研究评估薰衣草（Lavandula officinalis）EO纳米乳对虹鳟（Oncorhynchus mykiss）养殖的作用，显著提高生长和免疫；百里香（Thymus vulgaris）EO纳米乳作为大盖巨脂鲤管理的理想麻醉剂且不损害性能和福利；互叶白千层（Melaleuca alternifolia）EO纳米粒改善实验感染铜绿假单胞菌的Rhamdia quelen鲶鱼的抗氧化/氧化状态。纳米乳和EO纳米粒均可作为缩短水生生物麻醉诱导时间、改善鱼类生理响应的手段。但尚无研究直接比较香茅（C. winterianus）EO纳米乳与PCL纳米粒对大盖巨脂鲤运输应激的缓解作用。过氧化氢酶（Cat）、超氧化物歧化酶（Sod）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等酶构成抗氧化酶复合体，是抵御活性氧（ROS）所致氧化损伤的第一道防线之一，主要针对超氧阴离子（O₂^?）、羟自由基（OH^?）和过氧化氢（H₂O₂）。显著升高导致氧化应激过程，引起脂质氧化（细胞膜过氧化）、蛋白质损伤（变性）和核酸氧化（突变）。大盖巨脂鲤是南美洲最具商业价值的本土鱼类，因其驯化特性良好；目前这一体型健壮的鲶鱼在亚洲引起显著兴趣，2024年中国等国家产量超过5500万吨，超过哥伦比亚、秘鲁和巴西。鉴于该物种显著的经济重要性，本研究旨在评估香茅EO以纳米乳形式或包封于纳米粒形式对大盖巨脂鲤麻醉效果、复苏及抗氧化酶转录调控的影响。研究假设基于纳米乳和纳米粒均具有可能增强活性成分（香茅EO）递送和效力并降低运输应激的理化特性；具体认为NE-EOCW将提供更稳定的生理特征和更快复苏，而PCLN-EOCW将因PCL纳米胶囊诱导更深更持久的镇静，这些差异将反映在运输期间和之后cat和sod的转录表达上。

研究人员开展了以下研究：研究经米纳斯吉拉斯联邦大学非动物使用伦理委员会批准（注册号233/2025），在水产养殖实验室进行两项实验，以香茅（C. winterianus）精油（EOCW）、EOCW纳米乳（NE-EOCW）和负载EOCW的聚-ε-己内酯纳米粒（PCLN-EOCW）作为麻醉剂。幼鱼在循环水产养殖系统（RAS）28 L水箱中驯化两周，密度为每箱10尾，温度26.9 ± 0.1 °C、pH 6.4 ± 0.3、溶解氧7.3 ± 0.4 mg L^?1、毒性氨< 0.05 mg L^?1，每日两次投喂商业膨化饲料至表观饱食，两项实验前均禁食24 h。EOCW经气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析，采用DB5毛细管柱，氦气为载气，程序升温，保留指数以Van den Dool和Kratz方程用正构烷烃（nC8–nC18）计算，化合物按面积归一化（%）定量。NE-EOCW采用改良方法制备：5%（w/w）EOCE、1%（w/w）Tween 80和94%（w/w）去离子水，先以Ultra-Turrax 14,500 rpm均质10 min，再以探针超声（70%振幅，750 W，20 kHz）五个循环（各4 min，2 min开2 min关）处理，全程冰浴控温，所得纳米乳4 °C避光保存并于20天内使用。PCLN-EOCW基于溶剂蒸发法制备：130 mg PCL（分子量48,000 g mol^?1）溶于27 mL氯仿，加入4 mL OECW和4 mL Tween 80，混匀后经输液泵以300 μL min^?1逐滴加入53 mL蒸馏水并磁力搅拌，持续搅拌至氯仿完全蒸发（约24 h），补加蒸馏水维持终体积，4 °C保存。纳米制剂表征采用ZetaPALS仪测定zeta电位和动态光散射（DLS）粒径，样品经蒸馏水稀释，每参数五次连续读数，PDI由DLS相关函数累积量分析计算，25 °C测定，制备后3、15、30和60天评估稳定性，每参数10次读数。包封率（EE）和载药量（LC）测定：EOCW甲醇溶液紫外-可见吸收光谱确定最大吸收波长λmax为273.6 nm，据此以0.1–1.0 mg mL^?1香茅油标准溶液建立标准曲线；取0.5 g PCLN-EOCW乳液以甲醇定容至10 mL，混匀10 min后5000 RCF xg离心10 min，上清液五倍稀释，以绝对甲醇为空白在273.6 nm测定，三平行，按公式（1）和（2）计算EE%和LC%。实验1评估160尾鱼种暴露于EOCW、NE-EOCW和PCLN-EOCW（25–150 mg L^?1）的诱导和复苏时间。实验2以定量PCR评估93份大盖巨脂鲤肝脏样本中抗氧化酶（cat和sod）的转录响应，取样时间为运输结束后即刻（IAT）、暴露于EOCW、NE-EOCW、PCLN-EOCW及其各自对照（无醇与含醇）后24 h和72 h。

主要关键技术方法方面：一是气相色谱-质谱联用（GC-MS）结合GC-FID对香茅精油进行化学成分定性与定量分析；二是超声法制备纳米乳（NE-EOCW）与溶剂蒸发法制备聚-ε-己内酯纳米粒（PCLN-EOCW）；三是动态光散射（DLS）与zeta电位分析及多分散指数（PDI）测定用于纳米制剂表征，并以紫外-可见分光光度法测定包封率（EE）和载药量（LC）；四是麻醉诱导与复苏行为学观测实验；五是实时定量PCR检测肝脏cat和sod基因转录表达。实验动物为米纳斯吉拉斯联邦大学水产养殖实验室驯化的大盖巨脂鲤幼鱼，未涉及其他样本队列来源。

研究结果方面，香茅精油化学成分分析显示，EOCW中主要化合物为香叶醇（28.79%）、香茅醛（24.33%）和香茅醇（16.49%）。纳米制剂表征显示，NE-EOCW具有稳定粒径（126–167 nm）、胶体稳定性（–25至–37 mV）和PDI在第3天0.19至第90天0.06之间；PCLN-EOCW在90天内粒径194–208 nm、zeta电位–16.8至–37.8 mV、PDI第3天0.12至第90天0.16，第15天降至0.08，EE为81.9%、LC为96.1%。麻醉诱导与复苏结果显示，EOCW、NE-EOCW和PCLN-EOCW诱导时间分别为35–127 s、37–404 s和33–388 s，复苏时间分别为167–287 s、127–255 s和143–285 s。抗氧化基因转录响应显示，NE-EOCW（10 mg L^?1）在长时间运输（24 h）暴露72 h时降低cat和sod的mRNA水平，而含醇对照在相同条件下提高转录水平。由此得出，纳米制剂在不损害水质的前提下提高麻醉效率并调控氧化应激转录响应。

讨论部分总结：本研究首次在相同实验条件下直接比较香茅EO纳米乳与PCL纳米粒对大盖巨脂鲤运输应激的缓解作用，验证了关于两种纳米制剂在镇静深度、复苏特征及cat和sod转录表达上存在差异的假设。纳米乳释放快、复苏较快，PCL纳米粒因聚合物基质降解缓慢而具更高物理稳定性和更持久释放潜力，二者均在90天内保持胶体稳定且包封率与载药量较高，说明纳米化可提高EO均一性与稳定性、降低所需浓度并减轻副作用；NE-EOCW在长时间运输中降低cat和sod转录水平，提示其缓解氧化应激的作用，而含醇对照的升高则提示溶剂本身可能带来氧化负担。研究结论翻译如下：综上，这些纳米制剂在不损害水质的前提下提高了麻醉效率并调控氧化应激的转录响应，支持其作为热带水产养殖可持续纳米技术工具的潜在应用。