Boldine通过Nrf2介导的线粒体和铁死亡调节机制，改善由代谢功能障碍引起的脂肪性肝病

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Boldine ameliorates metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease via Nrf2-mediated mitochondrial and ferroptotic regulation

　　• 博尔丁（Boldine）可以稳定Nrf2并增强其转录活性。
• Nrf2/GPX4轴的激活能够抑制MASLD模型中的铁死亡（ferroptosis）。
• 博尔丁能够恢复肝细胞中的线粒体功能和氧化还原平衡。
• 抑制Nrf2会减弱博尔丁的保护作用。
• 针对Nrf2-铁死亡轴可能是治疗MASLD的潜在策略。

**引言**
代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD，Y. Li等人，2024年）曾被称为非酒精性脂肪肝病（NAFLD，Lin、Zheng、Dai、Wu和Zhang，2025年），现已成为全球主要的健康挑战，这与肥胖、胰岛素抵抗以及其他代谢综合征成分的发病率上升相匹配（Hutchison、Tavaglione、Romeo和Charlton，2023年）。MASLD代表了从单纯肝脂肪变到脂肪性肝炎、晚期纤维化和肝硬化的病理谱系（Peleman、Hellemans等人，2024年）。尽管对其发病机制有了更多的了解，但目前还没有专门针对MASLD的药物治疗被批准，这突显了寻找新靶点和治疗策略的迫切需求（Peleman、Francque和Berghe，2024年）。全球约有30%的成年人受到MASLD的影响（Riazi等人，2022年）。在中国和亚洲，随着肥胖和代谢综合征的迅速增加，MASLD在成年人中的发病率已达到约29.6%（J. Li等人，2019年）。

氧化应激是MASLD的核心驱动因素，导致肝细胞损伤、线粒体功能障碍和慢性炎症（El-Sehrawy等人，2025年）。活性氧（ROS）的过度产生主要是由脂质代谢紊乱和抗氧化系统受损引起的（Akl、Li和Widenmaier，2024年），这会促进膜脂质过氧化并放大炎症级联反应（Wang等人，2024年）。最近的研究表明，铁死亡（一种依赖铁的非凋亡性细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化失控）是MASLD中肝细胞损伤的关键机制（Park等人，2024年）。铁死亡由细胞内铁过量积聚和脂质氢过氧化物触发，导致膜氧化损伤和细胞死亡（Zhang等人，2022年）。值得注意的是，抑制铁死亡已被证明可以在脂肪性肝炎的实验模型中减轻肝脏炎症和纤维化，表明其作为MASLD治疗靶点的相关性（Muri和Kopf，2021年）。

在对抗铁死亡的内源性防御机制中，Nrf2-GPX4信号轴在维持氧化还原稳态和防止脂质过氧化物积累方面起着关键作用（W. Yang等人，2022年）。Nrf2是一种主要的氧化还原敏感转录因子，在氧化应激下会转移到细胞核并激活抗氧化反应元件（AREs）驱动的基因（Chen等人，2022年）。其最重要的下游靶点之一是GPX4，这是一种含有硒的酶，可以解毒脂质氢过氧化物并直接抑制铁死亡性细胞死亡（Yuan、Zhai、Chen、Xu和Wang，2021年）。在氧化性肝病的临床前模型中，增强Nrf2-GPX4活性已显示出对肝细胞损伤的保护作用，这支持了其在MASLD干预中的潜在价值（Xu等人，2024年）。

博尔丁（BD）是一种天然的阿扑啡生物碱，具有强大的抗氧化、抗炎和细胞保护作用（Lamba、Dwivedi、Yadav和Yr，2024年）。已知它能够提高细胞内谷胱甘肽水平并清除活性氧，从而防止药物引起的肝损伤和脂质过氧化（Sáez等人，2024年）。鉴于铁死亡在代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD）发病机制中的核心作用，我们研究了BD是否通过激活Nrf2-GPX4轴来抑制铁死亡从而改善MASLD。

尽管越来越多的证据支持铁死亡和Nrf2信号通路在MASLD中的作用，但药物调节Nrf2是否能有效缓解铁死亡相关的肝损伤仍不完全清楚。特别是，目前尚不清楚具有已知抗氧化特性的生物活性小分子博尔丁（BD）是否能够调节Nrf2/GPX4轴，从而影响MASLD背景下的线粒体稳态和铁死亡。

在这项研究中，我们旨在探讨BD对MASLD的保护作用及其潜在的分子机制。我们假设BD通过增强Nrf2活性来缓解MASLD，导致Nrf2/GPX4通路的激活、线粒体功能的恢复以及铁死亡的抑制。为了验证这一假设，我们使用了高脂肪饮食（HFD）诱导的MASLD小鼠和FFA处理的肝细胞，并通过综合分子方法进一步探讨了BD与Nrf2之间的相互作用。

博尔丁（纯度≥98%）和盐酸吡格列酮（作为阳性对照）购自上海元叶生物科技有限公司。高脂肪饮食（HFD，60%热量来自脂肪）由上海舒义舒尔生物科技有限公司提供。用于测量天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的商业试剂盒来自南京剑桥生物工程有限公司。Oil Red O染色试剂盒和ROS检测试剂盒来自Report Biotechnology（中国）。Bodipy染色试剂盒和Nrf2抑制剂ML385来自Cayman Chemical（美国密歇根州安纳堡）。组织铁含量检测试剂盒和TUNEL测定试剂盒分别来自北京博克bio公司和中信基因科技有限公司（天津）。JC-1染色试剂盒来自北京Solarbio科技有限公司；NAD+/NADH测定试剂盒来自上海贝奥时光生物科技有限公司。

我们从北京SPF生物科技有限公司购买了52只6-8周大的雄性无特定病原体（SPF）C57BL/6J小鼠（体重20±2克，许可证编号SCXK [北京] 2019-0010）。适应一周后，小鼠被随机分为六组：正常饮食组、HFD组、三个BD处理组（每日口服2.5、5和10毫克/公斤）以及吡格列酮（PIO，每日口服1.95毫克/公斤）组。BD悬浮在0.5%羧甲基纤维素（CMC-Na）中。所有HFD组均喂食HFD。正常饮食组和HFD模型组在同一时期每天通过口服给予等体积的0.5% CMC-Na载体。所有HFD组从第8周开始每天口服给药6周。第14周，在异氟醚麻醉下对小鼠实施安乐死。收集血液和肝脏组织；部分肝脏组织用4%甲醛固定用于组织学分析，其余部分储存在-80°C。所有程序均得到华北科技学院动物伦理委员会的批准，符合动物实验的伦理指南（批准编号2023-SY-074）。

肝脏组织用4%甲醛固定，脱水后包埋于石蜡中，并切成4微米厚的切片。切片用苏木精和伊红染色，并用中性树脂封片以便显微镜检查。

新鲜的肝脏组织用OCT化合物包埋，并切成20微米厚的冰冻切片。按照制造商的方案进行Oil Red O染色（河北瑞帕特生物科技有限公司），然后用光学显微镜观察切片。脱蜡的肝脏切片使用高压锅进行抗原修复（重复三次）。用PBS清洗后，在室温下用过氧化氢封闭内源性过氧化物酶15分钟。切片在4°C下过夜孵育，加入针对GPX4（1:200）和Nrf2（1:200）的一抗。第二天，在37°C下加入二抗（山羊抗小鼠或山羊抗兔）孵育1小时。使用DAB显色剂进行染色，然后将切片密封并在显微镜下检查。

在14周的实验期结束时，从眼静脉丛收集血液样本，在室温下静置1小时使其凝结。血清通过在4°C下以3000 rpm离心15分钟获得，并储存在-20°C直到分析。使用北京瑞成盛达生物工程有限公司提供的商业试剂盒测量血清中的铁离子、ALT、AST、TBIL和TC浓度。使用南京剑桥生物工程有限公司提供的试剂盒按照制造商的方案测定血清和肝脏组织中的MDA和SOD水平。

使用Trizol试剂从肝脏组织中提取总RNA，并使用Promega有限公司的试剂盒进行反转录。qRT-PCR按照以下热循环方案进行：95°C预热3分钟，然后是45个循环，每个循环包括95°C 20秒、55°C 20秒和72°C 20秒，最后在4°C下保温。使用2^-ΔΔCt方法量化HO-1、GSTM3、ACSL4、Ferritin、P53和STAT1的相对mRNA表达，以Cyc作为内参基因。引物序列列在表1中。

来自对照组、HFD组和HFD+BD（5毫克/公斤）组的肝脏组织使用Illumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序（苏州Panomik Biomedicine Technology Co., Ltd.）。进行了差异基因表达和通路富集分析。

在麻醉状态下通过门静脉注射胶原酶IV从6-8周大的雄性小鼠中分离原代肝细胞。消化后，将肝脏组织切碎并通过50微米孔径的滤网过滤。细胞在50×g的离心力下沉淀，并在含有10%胎牛血清（FBS，CeGrogEn Biotech，德国）和1%青霉素-链霉素（Biological Industries）的高葡萄糖DMEM培养基中于37°C和5% CO2培养箱中培养。AML-12细胞（上海中桥新洲生物科技有限公司）在含有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM中于37°C和5% CO2下培养。使用前进行了细胞系鉴定。原代肝细胞培养至80%汇合度，然后暴露于0.5 mM FFA（油酸钠：棕榈酸钠，2:1）24小时。随后，细胞同时暴露于BD（1.4 μM）和ML385（5 μM）再24小时。对照组仅接受载体处理。处理后收集细胞进行后续分析。

为了确保实验安全性，使用CCK-8试剂评估了BD对AML-12细胞的细胞毒性。BD在浓度高达7 μM时未表现出显著的细胞毒性（图S2），选择1.4 μM作为后续体外实验的安全工作浓度。细胞用4%甲醛固定20分钟，用PBS冲洗，然后用Bodipy染色试剂盒（Cayman Chemical，美国）染色。图像通过荧光显微镜捕获。

细胞用4%甲醛固定并用0.1% Triton X-100渗透。使用Report Biotechnology（中国）的商业试剂盒进行TUNEL染色。

脱蜡的肝脏切片使用高压锅进行抗原修复3分钟（重复三次）。用PBS清洗后，用过氧化氢在室温下封闭内源性过氧化物酶15分钟。切片在4°C下过夜孵育一抗GPX4（1:200）和Nrf2（1:200）。第二天，在37°C下加入二抗（山羊抗小鼠或山羊抗兔）孵育1小时。使用DAB显色剂进行检测，然后将染色切片密封并在显微镜下观察。

在14周的实验期结束时，从眼静脉丛收集血液样本，并在室温下静置1小时使其凝结。血清通过3000 rpm离心15分钟在4°C下获得，并储存在-20°C直到分析。使用北京瑞成盛达生物工程有限公司提供的商业试剂盒测量血清中的铁离子、ALT、AST、TBIL和TC浓度。使用南京剑桥生物工程有限公司的试剂盒按照制造商的方案测定血清和肝脏组织中的MDA和SOD水平。

使用Trizol试剂从肝脏组织中提取总RNA，并使用Promega有限公司的试剂盒进行逆转录。qRT-PCR按照以下热循环方案进行：95°C预热3分钟，然后是45个循环，每个循环包括95°C 20秒、55°C 20秒和72°C 20秒，最后在4°C下保温。使用2^-ΔΔCt方法量化HO-1、GSTM3、ACSL4、Ferritin、P53和STAT1的相对mRNA表达，以Cyc作为内参基因。引物序列列在表1中。

使用Illumina NovaSeq 6000平台（苏州Panomik Biomedicine Technology Co., Ltd.）对对照组、HFD组和HFD + BD（5毫克/公斤）组的肝脏组织进行转录组测序。进行了差异基因表达和通路富集分析。

在麻醉状态下通过门静脉注射胶原酶IV从6-8周大的雄性小鼠中分离原代肝细胞。消化后，将肝脏组织切碎并通过50微米滤网过滤。细胞在50×g的离心力下沉淀，并在含有10%胎牛血清（FBS，CEgrogEn Biotech，德国）和1%青霉素-链霉素（Biological Industries）的高葡萄糖DMEM培养基中于37°C和5% CO2培养箱中培养。AML-12细胞在含有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM中于37°C和5% CO2下培养。使用前进行了细胞系鉴定。原代肝细胞培养至80%汇合度，然后暴露于0.5 mM FFA（油酸钠：棕榈酸钠，2:1）24小时。然后细胞同时与BD（1.4 μM）和ML385（5 μM）共处理24小时。对照组仅接受载体处理。处理后收集细胞进行后续分析。

为了确保实验安全性，使用CCK-8试剂在AML-12细胞中评估了BD的细胞毒性。BD在浓度高达7 μM时未表现出显著的细胞毒性（图S2），选择1.4 μM作为后续体外实验的安全工作浓度。细胞用4%甲醛固定20分钟，用PBS冲洗，然后用Bodipy染色试剂盒（Cayman Chemical，美国）染色。图像通过荧光显微镜捕获。

细胞用4%甲醛固定并用0.1% Triton X-100渗透。使用中信基因科技有限公司的商业试剂盒进行TUNEL染色。使用DAPI进行核染色。荧光显微镜用于可视化。

原代肝细胞用胰蛋白酶（不含EDTA）消化，用PBS冲洗两次，然后在结合缓冲液中（1×10^6细胞/毫升）用FITC和PI染色15分钟在黑暗中。使用流式细胞术在1小时内分析凋亡细胞。使用单染色对照组进行补偿，并将四胞室分开以区分早期凋亡、晚期凋亡、坏死和存活细胞。使用DCFH-DA探针和ROS测定试剂盒（Report Biotechnology，中国）检测ROS水平。荧光图像通过荧光显微镜捕获。

在玻璃底 dish上生长的原代肝细胞固定、渗透并用含有10%驴血清的PBS封闭。细胞与主要抗GPX4抗体孵育过夜，然后加入荧光标记的二抗。图像通过共聚焦激光扫描显微镜捕获。

从肝脏组织或原代肝细胞中提取蛋白质，使用Bradford方法进行定量，并通过SDS-PAGE进行分离。转移后，膜被封闭并用针对P-Nrf2（ABclonal）、Nrf2（ABclonal）、Keap1（ABclonal）、Ferritin（Abmart）、SLC7A11、GPX4、Bax、Bcl-2和Caspase-3（均为HUABIO）的抗体进行探针检测。使用ECL软件可视化条带并使用ImageJ软件进行定量。

Nrf2的晶体结构（PDB ID：2Flu）来自RCSB蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/）。BD的化学结构来自TCMSP（传统中药系统药理学数据库和分析平台）。使用AutoDock Vina（美国）按照标准配体及受体制备协议进行对接模拟。

AML-12细胞用BD或DMSO处理24小时。裂解并离心后，将裂解物分装并在37°C至54°C（37、38、41、45、50、54°C）的温度范围内进行热变性。样品冻融后离心，并通过Western blotting检测Nrf2的蛋白质稳定性。

使用商业NAD+/NADH测定试剂盒根据制造商的说明测量细胞内NAD+/NADH水平。简要来说，制备了一系列浓度的标准溶液，并在450 nm处测量其吸光度以生成标准曲线。然后在相同条件下测量样品的吸光度，并根据标准曲线方程计算细胞内NAD+/NADH水平。

使用JC-1染色评估线粒体膜电位（ΔΨm）。简要来说，将50 μL JC-1染色溶液稀释在8 mL超纯水中制备工作溶液。细胞在37°C下与JC-1工作溶液孵育20分钟，然后用1× JC-1缓冲液洗涤三次以去除多余染料。然后在荧光显微镜下捕获荧光图像，并根据红色荧光（JC-1聚集体）与绿色荧光（JC-1单体）的比率来评估线粒体膜电位。体内数据（每组n=8）以平均值±平均值的标准误差（SEM）表示，而体外数据（n=3个独立实验）以平均值±标准偏差（SD）表示。使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Student–Newman–Keuls事后检验（SPSS v25.0）进行统计比较。差异在P < 0.05时被认为是统计学上显著的（*），在P < 0.01（**）或P < 0.001（***）时被认为是高度显著的。图表使用GraphPad Prism 8.0生成。

**BD缓解HFD诱导的MASLD小鼠的肝脂肪变性和肝损伤**
为了评估BD对代谢性肝损伤的保护作用，我们通过连续14周的高脂肪饮食（HFD）建立了MASLD小鼠模型，并在第8周至第14周施加BD干预（图1B）。HFD喂养的小鼠在第8周时体重显著增加，到第14周时这种增加更加明显（图1D）。值得注意的是，与未经BD处理的HFD喂养小鼠相比，BD治疗显著降低了体重增加（图1E）。通过H&E和Oil Red O染色进行的组织学分析显示……

**讨论**
与代谢功能障碍相关的脂肪性肝病（MASLD）已成为全球健康挑战，其患病率超过30%，并且随着肥胖和胰岛素抵抗率的上升而增加（Targher, Byrne, & Tilg, 2024）。尽管负担不断增加，但目前尚无FDA批准的药物治疗方法（Dai et al., 2021）。最近的研究确定了氧化应激和铁死亡（ferroptosis）是MASLD进展的关键病理驱动因素（Yan, Yang, Qin, & Hao, 2024），这突出了新的……

**结论**
总之，本研究确定boldine（BD）是一种对抗高脂饮食诱导的MASLD的强大天然物质。我们的发现表明，BD直接结合并稳定Nrf2，促进其向细胞核的转移，从而激活Nrf2/GPX4抗氧化轴。这一信号级联通过上调抗铁死亡标志物（GPX4, SLC7A11）并抑制ACSL4来抑制脂质过氧化和肝铁死亡。此外，BD还能恢复线粒体功能……

**作者贡献声明**
郭月：研究、数据管理。朱学锋：撰写-审稿与编辑、项目管理。李星：验证、方法学、正式分析、数据管理。齐亚娟：撰写-审稿与编辑、监督、项目管理、研究、资金获取、概念构思。梁欣文：验证、软件、资源。胡长平：资源、方法学、研究。吴乃军：资源、方法学、研究。刘思琪：撰写-审稿与编辑……

**伦理声明**
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究得到了华北科技大学的实验动物伦理与福利委员会的批准。（批准编号2023-SY-074）

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

**关于手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明**
在准备本工作时，作者使用了Gemini工具来改进语言和可读性，并确保符合期刊的格式要求。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。

**资助**
本研究得到了河北省中医药联合基金（编号H2022209087）、河北省科技厅-中央政府引导的地方科技发展基金项目（基础研究类别[264Z2603G]）、唐山市科技计划重点研发项目（编号25150212E）、河北省医学科学研究项目（编号20260636）以及国家自然科学基金（编号……）的支持。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。