重组腺病毒血清型4型在小鼠模型中的转基因表达动力学与复制潜力及其作为单纯疱疹病毒疫苗的应用

《Journal of Virology》：Transgene expression kinetics and replication potential of recombinant adenovirus serotype 4 in a mouse model and its use as a herpes simplex virus vaccine

　　

人腺病毒血清型4型（Ad4）被用作一种复制活性的口服疫苗，可安全有效地预防美国军事人员中的Ad4呼吸道疾病。重组Ad4候选疫苗已在仓鼠、非人灵长类动物和人类中诱导针对呼吸道病毒的黏膜和系统性免疫应答。尽管考虑到可用的免疫学工具数量众多，在小鼠中评估Ad4候选疫苗将极为有用，但这因对这些动物中病毒复制减弱的担忧而受到限制。在此，研究人员生成了表达荧光素酶（Ad4-Luc）、绿色荧光蛋白（Ad4-EGFP）或单纯疱疹病毒2型（HSV-2）糖蛋白D（Ad4-gD2）的重组Ad4载体，以鉴定转基因表达动力学、Ad4载体复制的存在情况以及针对HSV-2的免疫应答和保护作用。在BALB/c和人源化小鼠经鼻内接种后，从7小时至20天均观察到局部荧光素酶活性。随后用Ad4-Luc再次接种显示，BALB/c小鼠中荧光素酶表达降低，而人源化小鼠中表达强劲，表明野生型小鼠对载体产生了免疫应答。在用西多福韦处理后再接种Ad4的BALB/c小鼠肺中，Ad4 DNA产量减少，但荧光素酶活性未减少，这表明Ad4在肺中发生了复制，尽管水平较低。用Ad4-gD2对小鼠进行鼻内疫苗接种可在血清中产生HSV-2中和抗体，并且在HSV-2阴道内攻击后，可降低疾病评分、提高存活率并减少病毒脱落。总体而言，BALB/c小鼠模型对Ad4黏膜感染呈半允许性，但其转基因表达足以用于研究基于Ad4的候选疫苗。

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一、研究背景与目的

人腺病毒（HAdVs）是双链DNA病毒，在全球范围内引起高血清阳性率的呼吸道感染。其中，腺病毒血清型4型（Ad4）作为一种复制活性口服疫苗，在美国军事人员中安全有效地预防了Ad4呼吸道疾病，其有效性促使该疫苗于1971年至1999年在军事新兵中推广，并于2011年恢复至今，已接种超过1000万剂次，安全性记录极佳。这种复制活性腺病毒疫苗所引发的免疫原性和保护效果表明，它也可能作为表达其他病毒免疫原的疫苗载体发挥作用。然而，HAdV在大多数小鼠细胞系中复制不良，这限制了利用小鼠模型评估复制活性HAdV载体的实用性。具体而言，小鼠不表达CD46（群B和D型HAdV的关键进入受体），而属于E群的Ad4虽能进入多数小鼠细胞系并有效表达早期基因，但通常无法在这些细胞中复制。此外，小鼠细胞中腺病毒E1基因的抑制和复制必需蛋白的降解也可能限制病毒复制。鉴于这些限制，仓鼠更常被用作Ad4载体疫苗临床前开发的模型，但仓鼠的免疫学试剂相较于小鼠十分有限。因此，本研究旨在系统评估重组Ad4载体在小鼠模型中的转基因表达动力学和复制能力，并探索其作为单纯疱疹病毒2型（HSV-2）疫苗的可行性。

二、研究方法概述

研究人员首先通过同源重组或吉布森组装克隆技术，将荧光素酶（Luc）、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）或HSV-2糖蛋白D（gD2）基因插入Ad4基因组的E3区，构建了三种重组复制活性Ad4载体（Ad4-Luc、Ad4-EGFP和Ad4-gD2）。随后，采用体内和离体生物发光成像（IVIS Spectrum系统）追踪Ad4-Luc在不同品系小鼠（BALB/c和人源化NCG/NOG小鼠）中经不同途径（鼻内、肌内、口服灌胃、阴道内）接种后的转基因表达动力学。通过定量PCR检测肺组织中腺病毒DNA拷贝数，并使用荧光焦点感染剂量50%（FFID₅₀）试验评估感染性病毒颗粒的产生。利用抗病毒药物西多福韦（cidofovir）处理来探究Ad4在小鼠体内的复制情况。最后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和病毒中和试验评估Ad4-gD2疫苗的体液免疫反应，并通过阴道内HSV-2攻击实验评价其保护效力。

三、主要研究结果

体外表达验证

在A549人肺癌细胞系中，Ad4-Luc感染的细胞裂解液荧光素酶活性比未感染细胞高出约10³倍；Western印迹证实Ad4-gD2感染的A549细胞裂解液中存在约55kDa的HSV-2 gD蛋白条带。

不同接种途径的转基因表达模式

在BALB/c小鼠中，肌内注射Ad4-Luc在第4天于大腿部位产生最高的荧光素酶活性，其次是鼻内接种在鼻部产生的信号。口服灌胃和阴道内接种的荧光素酶活性大多低于检测阈值，仅有少数经口灌胃的小鼠因返流而在鼻部检测到信号。离体器官成像显示，鼻内接种后荧光素酶活性主要局限于肺部，而肌内注射后则主要在肝脏中检测到，提示病毒可能经血行播散。

转基因表达动力学

对19只BALB/c小鼠的汇总数据分析表明，鼻内接种Ad4-Luc后7小时即可在鼻部检测到荧光素酶表达，峰值出现在第4天，并可持续至少20天。在人源化小鼠中也观察到了相似的表达动力学。

重复接种与免疫应答

BALB/c小鼠在第二次鼻内接种Ad4-Luc后，鼻部平均荧光素酶活性较首次接种降低了23倍，同时血清中Ad4中和抗体滴度显著升高。相比之下，免疫缺陷的人源化小鼠在两次接种后均表现出相似水平的强劲荧光素酶活性，表明免疫活性小鼠对Ad4载体产生了适应性免疫应答，从而限制了二次感染。

Ad4在小鼠体内的复制证据

西多福韦治疗组与未治疗组相比，小鼠鼻部的体内荧光素酶活性无显著差异，离体肺组织的荧光素酶活性也无统计学差异。然而，西多福韦治疗组小鼠肺组织中的腺病毒DNA拷贝数显著低于对照组。此外，在FFID₅₀试验中，虽然第7天的终点滴度差异未达统计学显著性，但西多福韦治疗组小鼠肺匀浆在A549细胞上引起的感染性病毒滴度随时间变化的速率显著慢于未治疗组。这些数据共同表明，Ad4在小鼠肺中存在低水平的复制。

Ad4-gD2疫苗的免疫原性与保护效力

经鼻内途径接种两剂Ad4-gD2的BALB/c小鼠，其血清抗HSV-2 gD IgG抗体滴度显著高于口服灌胃和阴道内接种组，但低于可溶性gD蛋白联合佐剂肌内注射组。然而，鼻内Ad4-gD2组与可溶性gD肌内注射组诱导的血清HSV-2中和抗体滴度相当。在随后的致死性HSV-2阴道内攻击实验中，鼻内Ad4-gD2免疫组和可溶性gD肌内注射组均实现了100%的存活率，而口服灌胃组和阴道内接种组的存活率分别为40%和80%。鼻内Ad4-gD2免疫组还展现出最低的疾病评分和仅次于可溶性gD组的病毒脱落水平，其第2天的病毒脱落量较安慰剂组降低了108倍。

四、讨论与结论

本研究表明，Ad4载体在小鼠中经不同接种途径可导致不同组织和程度的转基因表达，这对于设计靶向特定组织免疫并控制毒性的Ad4载体系统具有指导意义。鼻内接种能够实现持续超过一周的转基因表达，并且西多福韦实验证实了Ad4在小鼠呼吸道中存在低水平复制，这暗示小鼠可用于初步评估Ad4载体疫苗。更重要的是，鼻内给予表达HSV-2 gD的重组Ad4载体能够诱导与可溶性蛋白加佐剂相当的HSV-2中和抗体，并提供完全保护，防止致死性HSV-2攻击，显著降低疾病严重程度和病毒脱落。尽管Ad4在小鼠中的复制受限，需使用较高剂量（10¹¹ IFU），但鉴于其在人体中具有良好的复制能力和安全记录，预期在人类中可实现更强效的免疫应答且所需剂量更低。研究也指出，预先存在的Ad4免疫力可能会降低重组Ad4的复制和免疫原性。总之，这些数据凸显了在BALB/c小鼠模型中研究基于Ad4载体的实用性，并证明了复制活性Ad4载体在未来疫苗开发中的巨大潜力。