《Animals》：From Silver Stains to Deep Learning: Neurohistological Analysis and Digital Mapping of the Brain of Domestic and Laboratory Animals in Veterinary Neuroscience
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神经组织学分析已从描述性显微镜检查和经典染色方法发展为定量化、标准化且日益自动化的研究范式。本叙述性综述基于PubMed、Scopus和Web of Science检索的文献，追溯了这种演化在家养动物（如狗、猫、马、牛、猪、绵羊和山羊）中的进程，并以人类和常见
神经组织学分析已从描述性显微镜检查和经典染色方法发展为定量化、标准化且日益自动化的研究范式。本叙述性综述基于PubMed、Scopus和Web of Science检索的文献，追溯了这种演化在家养动物（如狗、猫、马、牛、猪、绵羊和山羊）中的进程，并以人类和常见实验动物作为方法学比较对象。大体解剖、选择性染色、免疫组织化学（immunohistochemistry）和神经元示踪技术逐步扩展了可从大脑获取的结构和神经化学信息；而宏观与微观形态计量学，包括基于设计原则的体视学（design-based stereology），则实现了对脑体积和细胞数量的无偏估计。数字显微成像使组织切片变得可计算，机器学习和深度学习现允许直接从原始图像进行自动化分割，同时磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）和空间转录组学（spatial transcriptomics）将组织学与连接性和基因表达联系起来。然而，在家养动物中的直接证据仍局限于少数物种和脑区：标注数据集稀缺，数据整合不足，且大多数工具是基于人、小鼠或大鼠的大脑校准的。诸如CytoDArk0数据集和CISCA分割方法等开放资源是初步进展。未来的进步需要物种特异性脑图谱、共享协议以及经过验证且可解释的方法，这些方法应将物种间的解剖差异视为生物学信息而非噪声。
1. 引言
神经组织学分析自Hooke、Malpighi和van Leeuwenhoek首次对神经组织进行显微观察以来，一直是神经解剖学的核心。19世纪，选择性染色方法，尤其是Golgi的黑色反应被Ramón y Cajal采用，推动了神经元学说的形成。此后，大脑的组织学分析已从描述性显微术发展为定量化和日益自动化的分析。体视学使得从二维脑切片中无偏估计三维参数成为可能；数字显微术将脑切片转化为可计算的图像；机器学习和深度学习如今可直接从这些图像中提取相关特征。更近期，三维成像和空间转录组学开始将组织学与磁共振成像、同步辐射断层扫描和基因表达数据结合于多模态脑图谱中。然而，这些进展几乎完全是在人、小鼠和大鼠大脑上开发和验证的。尽管哺乳动物大脑具有共同的基本组织结构，但人类、实验室小鼠和大鼠与家养动物在大脑大小、皮层结构、区域比例和功能特化方面存在显著差异。因此，在人、小鼠或大鼠中获得的结果不能直接应用于兽医学物种。此外，许多兽医学物种的脑组织稀缺且来源异质，标准化的脑图谱、标注数据集和分析流程也较为缺乏。这些空白也具有临床相关性，因为许多家养动物的常见神经系统疾病是基于脑部病变进行诊断和描述的，包括犬的不明原因脑膜脑炎、颅内肿瘤、脑血管疾病以及与年龄相关的改变如犬认知功能障碍。比较性脑图谱在三个方面具有临床价值：首先，需要物种特异性脑图谱以在MRI和组织切片上定位病灶并将其与正常变异区分；其次，与人、小鼠和大鼠大脑的比较可显示哪些诊断标志物、影像标准和分析工具可以转移到家养动物，哪些需要物种特异性验证；第三，家养动物的几种自发性脑病类似于人类疾病，因此比较性脑图谱可以在“同一健康”视角下同时支持兽医诊断和转化研究。本文旨在：（i）描述研究大脑的神经组织学方法如何从经典染色发展到定量、计算和多模态方法，以及它们如何在兽医学感兴趣物种中得到应用；（ii）识别限制在人、小鼠和大鼠中开发的方法用于这些物种的主要因素；（iii）概述未来研究所需要的资源，如物种特异性脑图谱、共享数据集和经过验证的分析方法。
2. 方法
2.1 研究问题：本叙述性综述探讨以下研究问题：研究大脑的神经组织学方法在兽医学感兴趣物种中如何演变，以及在应用定量、机器学习、深度学习和多模态方法于这些物种大脑时，当前的挑战和机遇是什么。
2.2 定义与范围：本综述中，“计算性脑图谱构建”指为单个动物个体或物种创建大脑的数字地图。兽医学感兴趣物种包括狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊和羊驼。研究仅限于大脑；涉及脊髓或周围神经系统的研究不包括在内。
2.3 文献检索策略：在PubMed/MEDLINE、Scopus和Web of Science Core Collection中进行文献检索，时间覆盖1990年1月至2026年6月，最后一次检索于2026年6月15日执行。检索策略结合了三组术语。
2.4 研究筛选：三位作者独立根据纳入排除标准筛选记录，通过讨论解决分歧。
2.5 综述局限性：包括广泛的时间与分类学范围导致的选择性覆盖、无法进行正式定量综合、可能未包含非常近期的贡献、缺乏公开可及的兽医学物种脑数据集、以及现有分析框架中固有的注释偏差和人类中心假设。
3. 神经组织学技术的演进：从经典染色到三维成像
系统性比较神经解剖学的早期先驱是Félix Vicq d‘Azyr。选择性染色技术使神经组织的特定成分得以可视化：Golgi黑色反应可完整显示一小部分随机选择的神经元；Nissl染色标记神经元粗面内质网和胶质细胞及内皮细胞核，成为研究皮层分层、细胞密度和细胞构筑的基础；髓鞘染色和银染法揭示了纤维系统和白质结构。自20世纪40年代起，组织化学和免疫组织化学增加了神经化学维度。连接性最初通过Nauta和Gygax开发的银染变性轴突法研究，后被活体注射的轴突示踪剂取代。扩散加权成像和纤维束示踪术允许非侵入性重建假定的白质通路。宏观层面，白质束也可通过解剖分离法（Klingler技术）进行研究。由于组织学分析本质上是二维的，三维结构最早通过连续切片重建，随后采用配准方法。组织透明化方法结合光片或双光子显微镜现在允许对整个脑区或整个小型大脑进行体积成像，但其在牛和马等大型大脑中的应用需要大幅调整方案。
4. 从定量形态测量学到计算神经解剖学
4.1 大脑宏观形态测量学：宏观形态测量学在大体标本、连续切片或MRI上测量全脑及其主要分区的尺寸和形状。体积可通过Cavalieri原理无偏估计。
4.2 微观（组织学）形态测量学与体视学：在微观水平，基于设计原则的体视学通过系统随机抽样提供细胞数量、密度和体积的无偏估计。由于体视学劳动强度大，计算成像方法逐渐被采用。
4.3 数字图像分析与机器学习：显微术的数字化经历了渐进过程，从计算机辅助显微镜到扫描显微镜、CCD相机和机器视觉，随后是半自动化测量和统计分析。早期算法形态测量学依赖手工设计的描述符，在不同染色方案和物种间迁移性差。机器学习和深度学习将图像分析从基于规则的量化转变为直接从图像中学习特征。卷积神经网络、U-Net分割模型和Transformer架构现在是组织学图像分割和分类的主要工具。
5. 兽医神经解剖学中的计算组织学与细胞构筑分析
早期的计算机辅助组织学聚焦于Nissl染色切片的量化，如Grey Level Index。类似方法已被用于估算跨皮层区域的神经元和神经毡参数，但在马和偶蹄目等大脑物种中应用较少。针对细胞识别和分割的机器学习和深度学习方法随后被开发出来。在兽医神经病理学中，深度学习正越来越多地应用于神经系统之外。在兽医神经科学中，开放的CISCA框架和CytoDArk0数据集代表了解决标注稀缺问题的初步步骤。应用于兽医神经解剖学时，这些方法揭示了与运动适应、进化分歧和功能特化相关的皮层组织模式。
6. 从组织学参考到计算多模态脑图谱
脑图谱已从静态参考图演变为整合多种成像模式和生物数据的数字系统。经典图谱基于组织学切片、大体解剖和专家细胞构筑分区。现代脑图谱在共同的三维参考空间中组合多种空间尺度和数据类型。关键步骤包括Allen小鼠脑图谱、Allen人脑转录组图谱和Human Connectome项目。在其他物种中，图谱通常依赖于单一方法。空间转录组学、连接组学和高通量成像已将脑图谱扩展到形态学之外。在兽医神经科学中，此类资源仍然有限。确实存在一些物种特异性资源，但其范围和方法差异很大。少数多物种数据库可供使用，但覆盖范围和标注不一致。
7. 比较性脑图谱的临床与诊断意义
神经组织学分析和比较性脑图谱通过提供关于组织结构、病变分布、细胞病理学和物种特异性解剖变异的信息，有助于兽医神经学诊断。
7.1 炎症性、退行性和血管性病变的鉴别诊断：组织学检查可表征组织损伤和细胞反应，并结合临床和MRI结果支持对炎症、退行性和血管过程的区分。
7.2 区分正常年龄相关变化与病理改变：比较性脑图谱有助于区分生理性衰老与病理变化，特别是在有进行性行为或认知衰退的伴侣动物中。
7.3 MRI发现与微观组织结构之间的关联：MRI提供脑形态的非侵入性信息，而组织学可检查常规MRI无法分辨的细胞和微结构特征。
7.4 自然发生神经系统疾病中细胞和分子改变的识别：免疫组织化学和分子分析可以记录常规MRI无法检测的细胞和分子改变。
7.5 诊断模型与预后评估：数字组织学和人工智能有望标准化病变量化并减少观察者间变异性，但其在兽医患者中的诊断或预后价值尚未得到证实。
8. 当前挑战与未来方向
大多数大型研究基础设施、标准脑图谱、精选图像库和机器学习流程都是为人类、非人灵长类和小鼠开发的。兽医神经科学因此在大型计算和神经信息学计划中代表性不足。
8.1 解剖变异与人、小鼠和大鼠模型的转移：主要障碍之一是哺乳动物大脑之间的巨大解剖变异，这使得转移为人、小鼠或大鼠大脑开发的处理流程变得困难。
8.2 数据碎片化、标准化与标注：比较分析还受到组织制备、图像采集、处理和标注差异的限制。现有资源分散在不同机构，制作方法不同，常缺乏标准元数据和兼容标注。许多兽医学物种仍缺乏标准的立体定位坐标和全脑图谱。
8.3 未来方向：人工智能提供了克服这些局限的重要机会。未来进展将取决于三个互补方向：人工智能辅助组织分析、成像和分子数据的多模态整合，以及跨物种的明确比较框架。优先任务是开发结合细胞构筑、MRI、连接性和分子数据的多模态图谱。
9. 结论
本综述表明，大脑分析是通过累积而非替代性的方法学进步发展起来的。在家养动物中，直接证据仍限于少数物种和选定脑区，而在人类和实验动物中开发的大多数计算工具和多模态图谱仍处于潜在而非已验证的应用阶段。由此得出三个主要启示：第一，每个家养物种的参考脑图谱和定量规范性数据是兽医神经学和神经病理学的优先事项；第二，在人、小鼠和大鼠中开发的方法在使用前应在家庭动物大脑上进行验证，其输出应保持解剖学上的可解释性；第三，来自家养动物的脑组织和数字数据的开放共享将使当前的分析框架能够在不同物种的大脑中进行测试。
