《Animals》：Testicular and Rumen Microbial Responses to Selenium-Enriched Malt in Heat-Exposed Simmental Bulls
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本研究评估了富硒麦芽（selenium-enriched malt）对热暴露西门塔尔公牛睾丸及瘤胃微生物响应的影响。十八头公牛分别接受基础日粮或补充至目标硒水平0.3或0.5 mg/kg日粮干物质的日粮。宏基因组分析每组6头，宿主检测每组4头，RNA测序每组3
本研究评估了富硒麦芽（selenium-enriched malt）对热暴露西门塔尔公牛睾丸及瘤胃微生物响应的影响。十八头公牛分别接受基础日粮或补充至目标硒水平0.3或0.5 mg/kg日粮干物质的日粮。宏基因组分析每组6头，宿主检测每组4头，RNA测序每组3头。与对照组相比，高剂量组血清抗氧化指标和生殖激素浓度更高，炎症标志物更低，Johnsen评分更高，TUNEL阳性率更低。基因水平FDR控制分别鉴定出低剂量vs对照、高剂量vs对照和高剂量vs低剂量对比中23、1和4个差异表达基因。供应商报告的GSEA显示，对照vs低剂量和对照vs高剂量对比中类固醇生物合成（steroid biosynthesis）的标准化富集评分为负值，表明在供应商对比约定下富集偏向补充侧。qPCR显示低剂量组CYP11A1、CYP17A1、SCARB1和LDLR表达降低，而Bax、Bcl-2和CYP17A1蛋白丰度无差异。瘤胃微生物多样性和群落组成在各组间存在差异，事后选择的两个辅因子相关通路在低剂量组丰度较低。160个微生物组-睾丸或720个微生物组-血清关联均未通过FDR校正。补充与热暴露条件下有利的系统性和睾丸组织学响应以及剂量特异性分子和微生物变化相关。
**研究背景与问题**
热暴露是牛生产中的重要挑战，可扰乱生理调节并损害生殖组织。雄性生殖依赖于有效的睾丸体温调节，过度热应激可损伤生殖细胞并干扰精子发生。实验性睾丸高温还可改变公牛局部睾酮浓度和类固醇生成基因表达，系统性氧化和炎症反应可能伴随这些变化。因此，支持热暴露期间生理功能的营养策略对牛管理具有重要意义。硒（Se）通过参与细胞氧化还原调节的硒蛋白支持抗氧化防御和生殖生理。已有研究报道了含硒营养干预对热暴露牛的响应，包括育肥公牛中的硒酵母和奶牛中的羟基硒代蛋氨酸。然而，天然热暴露下富硒麦芽对睾丸的直接效应仍不完全清楚。胆固醇转运和类固醇生成提供了相关分子靶点，但仅凭转录本丰度不能确定类固醇产量的变化。瘤胃微生物组也可能对日粮硒和环境热产生响应。热暴露与牛微生物组成和功能差异相关。亚硒酸钠补充改变了荷斯坦公牛的瘤胃微生物种群和发酵相关性状，而肉牛研究已将含硒干预与微生物和宿主抗氧化响应联系起来。这些观察促进了对宿主和瘤胃性状的联合评估，但并未确立瘤胃微生物变化介导了富硒麦芽对睾丸的响应。胃肠道微生物群落通过代谢、免疫和内分泌相互作用与雄性生殖生理相关，但大部分证据来自人类或非反刍动物模型，其与牛瘤胃的相关性尚不确定。鉴于硒依赖蛋白参与抗氧化防御、氧化还原调节和雄性生殖生理，本研究选择富硒麦芽作为营养干预措施在环境热暴露下进行评估。研究人员因此评估了接受富硒麦芽的西门塔尔公牛在自然热暴露期间的血清指标、睾丸组织学、分子测量和瘤胃鸟枪法宏基因组学。研究假设补充与更有利的系统性和睾丸响应相关，并伴随睾丸基因表达和瘤胃微生物谱的剂量特异性变化。个体匹配的微生物组-宿主相关性被视为探索性分析。
**关键技术方法**
研究人员选用18头健康西门塔尔公牛（初始体重约500±50 kg），随机分为热暴露对照组（HS）、低剂量富硒麦芽组（HS+Se-L）和高剂量富硒麦芽组（HS+Se-H），每组6头，在江西宜春高安商业牛场进行56天饲养试验（2024年7月至9月自然夏季高温期）。富硒麦芽粉由飞跃生物技术有限公司（郑州）提供，标示硒浓度为2000 mg/kg。目标补充硒水平分别为0.3和0.5 mg/kg日粮干物质。环境温湿度每15分钟记录，计算温湿度指数（THI）。试验结束时每组随机选4头进行宿主检测（血清、组织学、TUNEL、qPCR、Western blot），每组3头进行RNA测序，全部18头进行瘤胃液采集和鸟枪法宏基因组测序。血清抗氧化指标（T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA）、炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和生殖激素（睾酮、LH、FSH、INHB）采用商业试剂盒测定。睾丸组织进行H&E染色和改良Johnsen评分，TUNEL法检测DNA片段化。RNA-seq使用Illumina NovaSeq X Plus平台，reads比对至Bos taurus参考基因组ARS-UCD1.3。qPCR检测STAR、CYP11A1、CYP17A1、SCARB1和LDLR表达，以ACTB为内参。Western blot检测Bax、Bcl-2和CYP17A1蛋白丰度。瘤胃宏基因组使用Illumina NovaSeq X Plus平台测序，Kaiju进行分类注释，DIAMOND比对KEGG数据库进行功能注释。
**研究结果**
**血清抗氧化、炎症和生殖内分泌响应**：通过Kruskal-Wallis检验和Bonferroni校正的Dunn事后比较，高剂量组血清T-AOC、SOD和GSH-Px值高于HS组，MDA浓度低于HS组（各指标校正p<0.01）。高剂量组血清TNF-α、IL-6和IL-1β浓度低于HS组（校正p<0.01）。高剂量组睾酮、LH、FSH和INHB浓度高于HS组（各指标校正Dunn p<0.01）。低剂量组均值变化方向相同，但经校正后与HS组的配对比较未达显著性阈值。
**睾丸组织学和TUNEL阳性率**：通过H&E染色和改良视野Johnsen评分，HS、HS+Se-L和HS+Se-H组平均Johnsen评分分别为6.275、7.350和7.900，高剂量组高于HS组（校正Dunn p=0.0050）。TUNEL阳性率分别为1.460%、0.885%和0.205%，高剂量组低于HS组（校正Dunn p=0.0070）。其他配对比较未达显著性。
**剂量特异性转录组响应**：通过RNA-seq主成分分析，PC1和PC2分别解释87.42%和6.70%的总方差，Se-H-3沿PC1与其他样本分离。基因水平FDR<0.05结合倍数变化阈值，在HS+Se-L vs HS、HS+Se-H vs HS和HS+Se-H vs HS+Se-L对比中分别鉴定出23、1和4个差异表达基因。KEGG GSEA在至少一个对比中鉴定出125条供应商报告q<0.05的通路。类固醇生物合成在对照vs低剂量（NES=-2.268，q<0.0001）和对照vs高剂量（NES=-2.111，q=0.0036）对比中显示负NES值，表明在供应商对比约定下富集偏向补充侧。靶向基因条目中，SCARB1和CYP11A1在HS+Se-L中表达低于HS并满足基因水平FDR阈值。
**qPCR验证**：通过qPCR检测，HS+Se-L组CYP11A1、CYP17A1、SCARB1和LDLR表达低于HS组（Bonferroni校正Dunn p分别为0.0181、0.0181、0.0324和0.0324）。STAR表达组间无显著差异（Kruskal-Wallis p=0.0775）。HS+Se-H组五个靶标平均表达数值上低于HS，但未检测到显著差异。
**睾丸Bax、Bcl-2和CYP17A1蛋白丰度**：通过Western blot分析，各组间睾丸Bax、Bcl-2和CYP17A1蛋白丰度无显著差异（Welch ANOVA p分别为0.480、0.173和0.866），Games-Howell配对比较均无显著性。
**瘤胃微生物组成和功能谱**：通过属水平多样性分析，Shannon多样性经FDR校正后组间存在显著总体差异（q=0.0083），检测到的属数无显著差异（q=0.5739），Simpson多样性组间存在差异（q=0.0214）。Bray-Curtis群落组成组间显著不同（PERMANOVA，R2=0.275，p=0.0027），多变量离散度无显著差异（PERMDISP，p=0.7227）。在HS+Se-L vs HS对比中检测到FDR支持的代谢通路差异，核黄素代谢和泛醌及其他萜类醌生物合成在HS+Se-L中相对丰度低于HS（q分别为0.0424和0.0449）。
**探索性微生物组-睾丸关联**：通过Spearman相关分析12头个体匹配公牛，评估80个微生物特征与Johnsen评分和TUNEL阳性率之间的160个关联，以及相同特征与9个血清指标之间的720个关联。在校正前观察到若干名义相关，但160个睾丸聚焦关联经Benjamini-Hochberg FDR校正后均未保持显著，治疗组校正敏感性分析中亦无显著关联。720个血清关联同样未通过FDR校正。
**讨论部分总结**
讨论部分指出，高剂量组显示血清抗氧化、炎症和生殖内分泌指标的协调差异，伴随更高的Johnsen评分和更低的TUNEL阳性率。硒依赖氧化还原调节为这些响应提供了生物学上合理的背景。较低循环炎症细胞因子浓度伴随较高抗氧化指标，与热暴露期间氧化还原平衡和炎症信号传导之间的相互作用一致。由于未测量局部睾丸氧化还原和炎症通路，血清发现最好解释为与组织变化同时发生的系统性响应。高剂量组较高的循环睾酮、LH、FSH和INHB表明在研究条件下更有利的生殖内分泌谱。硒在雄性生殖生理中已有确立的作用。这些激素数据补充了组织学发现，但未评估精液质量和生育力，且缺乏热中性组阻止了对非应激值恢复的估计。组织学发现提供了本研究最直接的睾丸证据。高剂量组较高的改良Johnsen评分和更好保留的生精上皮组织表明更有利的生精组织状态。热损伤可通过氧化和其他细胞过程影响生殖细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞。每只动物使用一个代表性视野限制了组织覆盖范围，但动物水平分析确定了HS+Se-H与HS之间的差异。高剂量组较低的TUNEL阳性率表明评估视野中可检测的DNA片段化较少，支持组织学结果。Bax和Bcl-2蛋白丰度无显著差异，表明组织响应未伴随这些蛋白的可检测变化。TUNEL染色测量DNA片段化，不识别负责的细胞死亡通路，因此组织发现不应具体归因于Bax/Bcl-2相关机制。CYP17A1蛋白丰度不变与高剂量组较高的循环生殖激素浓度形成对比，这种分歧强调组织、内分泌、转录本和蛋白测量捕获了不同水平的调控。一致的组织学和TUNEL发现仍是睾丸响应的主要证据。转录组结果按剂量和分析水平显著不同。基因水平FDR控制将名义筛选列表缩减至三个对比中分别23、1和4个支持基因，而GSEA鉴定了胆固醇和类固醇相关基因集。通路水平富集可检测未被许多单独显著基因代表的协调变化，但不能确立通路每个成员的激活。因此，在解释治疗模式时应考虑样本间变异和三头RNA-seq子集。低剂量qPCR结果与几个胆固醇处理和类固醇生成相关靶标（包括CYP11A1、CYP17A1、SCARB1和LDLR）的较低表达方向一致。相比之下，最清晰的组织学和内分泌响应出现在高剂量，且CYP17A1蛋白丰度未变。这些发现表明剂量特异性分子响应而非类固醇生成的均匀激活。类固醇生成依赖于底物可用性、内分泌刺激、酶活性和转录后调控以及mRNA丰度。这些调控水平可能促成观察到的分歧，但未直接测试。RNA-seq输出中重复的STAR和CYP17A1注释进一步限制了跨测序和靶向检测的简单一对一验证叙述。高剂量组织响应与较大低剂量转录响应之间的对比进一步突出了发现的剂量特异性。当前分子数据不能定义最佳剂量或确立单一机制序列。富硒麦芽补充伴随瘤胃微生物多样性和群落组成的差异，与先前含硒日粮瘤胃响应的报道一致。显著的PERMANOVA结果未伴随多变量离散度的可检测差异，支持处理间群落组成的差异。尽管更大的微生物多样性本身不应被解释为改善的瘤胃功能，这些结果证明了补充的群落水平微生物响应。在本文使用的通路水平分析中，HS+Se-L vs HS对比中检测到FDR支持的差异。主图中强调的两个辅因子相关通路——核黄素代谢和泛醌及其他萜类醌生物合成——在HS+Se-L中相对丰度低于HS。核黄素支持黄素依赖反应，日粮核黄素可影响瘤胃微生物和发酵性状。由于宏基因组丰度代表功能潜力，需要相应的代谢物或发酵测量来确定这些通路差异的生理后果。微生物响应呈剂量依赖性，且与睾丸组织学模式（在高剂量最清晰）不平行。这种剂量-响应模式的差异反对将微生物和睾丸发现解释为单一线性通路。因此，匹配关联分析用于探索特定微生物特征是否与直接睾丸终点协变。无论治疗组校正前后，睾丸聚焦微生物关联经FDR校正后均未保持显著。血清关联家族产生相同总体结果。因此，同时发生的瘤胃和宿主响应未识别出将补充与睾丸表型联系起来的特定微生物特征。这些探索性关联测试不是正式中介模型，当前结果不能解决瘤胃微生物变化是否促成睾丸响应。研究优势在于将直接睾丸组织学和TUNEL测量与血清、分子和瘤胃宏基因组数据整合，使用个体匹配动物允许微生物关联针对直接睾丸终点而非仅血清测量进行评估。局限性包括：宿主检测每组4头，RNA-seq每组3头，组织学定量每只动物一个视野，样本量限制了精度和统计功效；未包含热中性对照，基础日粮总硒浓度未化学定量，发现被解释为热暴露条件下治疗相关响应，不能定义向热中性状态的恢复或最佳硒剂量；未测量精液质量和生育力，发现涉及睾丸组织完整性和内分泌状态而非证明的生育力改善；补充水平报告为目标补充硒水平，麦芽载体的潜在效应不能完全与硒的效应分离；微生物功能谱未与瘤胃代谢物或发酵结果配对。在这些限制内，血清和直接睾丸发现的汇聚支持田间热暴露下富硒麦芽的营养响应。剂量特异性转录组和微生物发现为进一步确证研究提供了优先方向。
**结论翻译**
富硒麦芽补充，特别是目标为0.5 mg补充硒/kg日粮干物质的方案，与热暴露西门塔尔公牛更有利的系统性抗氧化、炎症和生殖内分泌谱、更高的Johnsen评分和更低的睾丸TUNEL阳性率相关。转录组和qPCR响应呈剂量特异性，而Bax、Bcl-2和CYP17A1蛋白丰度在处理间无差异。补充还伴随瘤胃微生物多样性、群落组成和选定功能谱的差异。这些发现表征了田间热暴露下的系统性、睾丸、分子和微生物响应，支持进一步评估富硒麦芽在牛营养中的应用；它们不能定义最佳硒剂量或确立微生物对睾丸响应的中介作用。
