《Journal of Virology》：PEDV NSP5 promotes immune evasion by recruiting TRIM28 to degrade DDX3X
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猪流行性腹泻病毒（PEDV）已成为主要的猪肠道冠状病毒，引起仔猪呕吐、腹泻、脱水和高度死亡。DEAD-box家族成员在病毒感染中发挥关键作用，但其在PEDV感染中的作用仍不明确。此外，PEDV及其蛋白是否调控这些DEAD-box蛋白的表达亦未知。本研究采用逆转
猪流行性腹泻病毒（PEDV）已成为主要的猪肠道冠状病毒，引起仔猪呕吐、腹泻、脱水和高度死亡。DEAD-box家族成员在病毒感染中发挥关键作用，但其在PEDV感染中的作用仍不明确。此外，PEDV及其蛋白是否调控这些DEAD-box蛋白的表达亦未知。本研究采用逆转录定量PCR检测15个DEAD-box家族成员在1月龄PEDV感染仔猪肠道组织中的基因表达变化。研究人员发现，DEAD-box解旋酶3 X连锁（DDX3X）在PEDV感染后表达上调，细胞实验中亦观察到类似结果。DDX3X过表达和敲低分别显著抑制和促进PEDV复制。此外，使用特异性DDX3X抑制剂证明DDX3X主要限制PEDV RNA积累。研究还表明，DDX3X通过促进TANK结合激酶1（TBK1）、干扰素调节因子3（IRF3）、信号转导和转录激活因子1（STAT1）及Janus激酶1（JAK1）蛋白的磷酸化增强RIG-I样受体（RLR）信号传导。免疫共沉淀和免疫荧光实验进一步证明DDX3X与TBK1和IRF3的关联和共定位，可能有助于其抗病毒功能。研究人员构建了所有PEDV蛋白并鉴定出NSP5通过泛素化降低DDX3X水平。此外，研究人员发现含三重基序蛋白28（TRIM28）与DDX3X相互作用并介导其K48连接泛素化。敲低TRIM28显著降低NSP5介导的DDX3X泛素化。总之，本研究阐明了NSP5通过泛素化途径拮抗DDX3X介导的抗病毒免疫反应的分子机制，为PEDV-宿主相互作用及抗病毒干预的潜在靶点提供了新见解。
研究背景：猪流行性腹泻（PED）由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起，是一种急性高度传染性肠道疾病，影响各年龄段猪只，2周龄仔猪死亡率达80%–100%，给全球养猪业造成重大经济损失。PEDV属冠状病毒科α冠状病毒属，基因组为约28,000个核苷酸的单股正链RNA，含7个开放阅读框（ORFs）。ORF1a和ORF1b编码两个大型复制酶多聚蛋白前体（pp1a和pp1ab），经病毒蛋白酶切割为16个非结构蛋白（NSP1–16）。这些非结构蛋白在病毒生命周期中发挥关键作用，并可调控宿主细胞增殖、免疫和代谢等功能。然而，目前对PEDV蛋白的功能表征研究不足，限制了对PEDV致病机制的理解。宿主因子不仅调控细胞功能，还调节病毒生命周期。DEAD-box蛋白在冠状病毒感染中发挥关键作用。DDX3X作为DEAD-box家族成员，具有ATP酶活性，参与RNA形成、代谢和外排，调控细胞周期、凋亡和先天免疫信号等过程。DDX3X对不同病毒呈现促病毒或抗病毒效应，如促进HCV、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、HIV和SARS-CoV-2复制，而抑制HBV、登革病毒、甲型流感病毒和新城疫病毒等复制。DDX3X的抗病毒机制尤其与先天免疫通路相关，可与RIG-I、MAVS、IKKε、TBK1和IRF3等细胞因子互作诱导ISGs表达。然而，DDX3X在猪肠道冠状病毒感染中的作用尚不清楚。因此，阐明DDX3X在PEDV感染中的功能和机制对于理解PEDV致病机制和开发有效治疗策略至关重要。
研究人员开展的研究及结论：本研究表明DDX3X在PEDV感染仔猪肠道中激活并限制PEDV复制。机制研究揭示DDX3X与TBK1和IRF3互作，增强PEDV感染期间RLR信号通路激活。然而，PEDV NSP5招募TRIM28介导DDX3X的泛素化降解，抑制抗病毒免疫反应。本研究全面分析了PEDV蛋白对DDX3X的调控效应和分子机制，有助于理解PEDV致病机制及其免疫逃逸策略，为抗PEDV药物开发提供新靶点。重要意义在于揭示了PEDV NSP5通过招募TRIM28靶向DDX3X降解从而抑制免疫反应的现象，深化了对PEDV NSP5免疫抑制作用和机制的理解，阐明了PEDV蛋白与宿主因子之间复杂的调控互作。
关键技术方法：研究人员使用1月龄长白仔猪（购自中国甘肃定西某猪场），经RT-qPCR和ELISA确认无PEDV感染后，随机分为三组，在P3生物安全实验室独立饲养，口服3×10? TCID??/mL PEDV G2c株LJX01/2014，感染后48小时安乐死并采集小肠组织。细胞实验使用Vero-E6、IPEC-J2和293T细胞系。主要技术包括：逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达；Western blot检测蛋白表达和磷酸化水平；病毒滴定（Reed-Muench法）；CCK8法检测细胞活力；免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白互作；免疫荧光 assay（IFA）检测蛋白共定位；质谱分析鉴定DDX3X互作蛋白；泛素化突变体（K11、K27、K48、K63）分析泛素连接类型。
研究结果：
1. PEDV在体内外上调DDX3X表达：通过RT-qPCR检测1月龄PEDV感染仔猪十二指肠、空肠和回肠中15个DEAD-box家族成员表达，发现DDX3X、DDX21和DDX25显著上调，DDX5和DDX41显著下调。Western blot显示PEDV感染仔猪小肠组织中DDX3X蛋白表达增加，空肠和回肠中最高。IPEC-J2细胞感染1 MOI PEDV后，DDX3X蛋白表达先升高后降低，与PEDV丰度正相关。表明DDX3X响应PEDV感染并显著上调。
2. DDX3X通过限制病毒RNA积累抑制PEDV复制：通过过表达和敲低DDX3X，RT-qPCR显示DDX3X过表达显著降低PEDV RNA水平，敲低则增加PEDV RNA水平。Vero-E6细胞滴定显示DDX3X过表达降低病毒滴度，敲低增加滴度，12 hpi差异近两个数量级。Western blot证实DDX3X抑制PEDV N蛋白表达。使用DDX3-IN-2抑制剂（2.5 μM）在复制阶段添加使PEDV M mRNA水平增加约10倍。进一步区分基因组RNA和含N亚基因组RNA，发现DDX3-IN-2增加两者水平，但含N亚基因组RNA增加更明显。表明DDX3X限制病毒基因组和亚基因组RNA积累。
3. DDX3X通过与TBK1和IRF3互作促进PEDV诱导的RLR信号通路激活：RT-qPCR显示DDX3X过表达上调MDA5、RIG-I、TRAF3、IKKε、TBK1、IRF3、NF-κB、IFN-β、IFN-λ1、STAT1、ISG15、OASL和Mx2表达，敲低则下调。Western blot显示DDX3X过表达增加MDA5、RIG-I蛋白水平和TBK1、IRF3、STAT1、JAK1磷酸化，敲低则相反。Co-IP显示DDX3X与IRF3和TBK1互作，与IRF3互作更强，PEDV感染后互作增强。IFA证实DDX3X与IRF3和TBK1在细胞质中共定位，尤其核周区域。表明DDX3X可能通过与TBK1和IRF3互作增强RLR信号通路激活。
4. NSP5介导DDX3X的K48连接泛素化：转染PEDV各蛋白后RT-qPCR显示NSP4、S1和S2显著上调DDX3X表达，N和M显著下调，NSP5和NSP9降低DDX3X蛋白水平而不影响基因表达，NSP5降低47%。使用3-MA、MG132和NH?Cl抑制自噬、蛋白酶体和溶酶体降解，发现MG132显著恢复NSP5表达细胞中DDX3X蛋白水平，表明NSP5促进蛋白酶体依赖性降解。Co-IP和IFA证实Flag-NSP5与内源性DDX3X互作和共定位。泛素化突变体实验显示NSP5主要介导DDX3X的K48连接泛素化，表明NSP5通过K48连接泛素化诱导DDX3X降解。
5. PEDV NSP5通过招募TRIM28促进DDX3X降解：MYC-DDX3X过表达和磁珠富集互作蛋白，银染显示265个潜在互作蛋白，质谱鉴定TRIM27、TRIM28、TRIP12和RNF41四个已知泛素化功能蛋白。Co-IP显示TRIM28与DDX3X互作，PEDV感染后增强。IFA证实TRIM28与DDX3X在细胞质中共定位。TRIM28过表达促进DDX3X的K48连接泛素化。NSP5不影响TRIM28 mRNA或蛋白水平。Co-IP和IFA证实NSP5与内源性TRIM28互作。敲低TRIM28降低NSP5介导的DDX3X K48连接泛素化，并减弱NSP5促进PEDV复制的能力。表明NSP5招募TRIM28介导DDX3X泛素化和降解，促进PEDV复制。
讨论部分总结：PEDV感染与宿主因子互作显著影响病毒致病性和抗病毒免疫反应。转录组和蛋白质组测序鉴定众多调控PEDV复制的宿主因子，包括IL家族、热休克蛋白家族和TRIM家族。本研究观察到DDX3X、DDX21和DDX25在PEDV感染中上调，DDX5和DDX41下调。DDX3X在不同病毒感染中作用具有高度背景依赖性，可能受病毒种类、毒株、宿主细胞类型、细胞代谢状态和特定抗病毒信号通路影响。本实验证实DDX3X过表达和敲低影响PEDV复制，药理学抑制证明其特异性限制PEDV复制而不影响病毒吸附、内化或释放，该效应与DDX3X和TBK1、IRF3互作促进RLR信号通路激活密切相关。冠状病毒蛋白对病毒生命周期至关重要。研究人员观察到NSP4和S1、S2显著上调DDX3X表达，可能增强宿主抗病毒免疫反应抑制病毒复制，因此PEDV可能通过下调DDX3X表达拮抗这种激活。RT-qPCR显示PEDV N和M蛋白降低DDX3X mRNA表达。此外，某些病毒蛋白可与DDX3X互作破坏其免疫激活功能。本研究发现PEDV通过宿主蛋白酶体降解系统靶向降解DDX3X。NSP5而非N蛋白促进DDX3X的K48连接泛素化。NSP5是免疫抑制蛋白，其主要蛋白酶活性靶向NEMO、POLDIP3、GSDMD和HDAC6等抗病毒蛋白。研究人员构建NSP5催化残基单点突变体（H41A或C144A）及双突变体，发现三者均保留降低DDX3X蛋白水平和促进泛素化能力，表明H41和C144残基非NSP5介导DDX3X泛素化和降解所必需。通过免疫共沉淀联合质谱鉴定四个泛素化相关蛋白，证实TRIM28而非TRIM27和RNF41介导DDX3X泛素化。TRIM28促进PEDV复制通过诱导线粒体自噬减弱MAVS介导的抗病毒免疫，与本研究发现TRIM28是促进PEDV复制的宿主因子一致。TRIM28作为E3泛素连接酶底物谱尚未完全阐明，可靶向MAVS或BRD7泛素化降解。因此DDX3X可能非TRIM28唯一底物，NSP5招募TRIM28抑制DDX3X抗病毒活性可能仅为NSP5免疫抑制策略之一。
研究结论翻译：总之，研究人员的数据揭示了DDX3X与PEDV复制之间的复杂互作。DDX3X作为抗病毒因子响应PEDV感染，通过与TBK1和IRF3关联增强RLR介导的抗病毒免疫并限制PEDV复制。相反，PEDV NSP5招募TRIM28通过K48连接泛素化促进DDX3X降解，从而逃逸宿主抗病毒反应。本研究为PEDV致病机制提供了有价值的见解，并为猪肠道病毒防控提供了理论基础。
