奎尼丁与维拉帕米对OCTN1介导的乙酰胆碱转运的抑制及其trans-抑制机制研究

《BBA Advances》：Inhibition of the OCTN1-mediated acetylcholine transport by quinidine and verapamil

　　

有机阳离子转运体新型成员1（OCTN1）属于SLC22家族，介导非神经元胆碱能系统（NNCS）中的乙酰胆碱（ACh）转运。奎尼丁与维拉帕米对ACh摄取呈现混合型抑制，并对ACh转运表现出trans-抑制。OCTN1对ACh外排的trans-抑制可能为靶向肿瘤胆碱能信号提供依据。OCTN1是一种膜转运蛋白，与OCTN2共同构成SLC22A4与SLC22A5小亚组，二者序列一致性超过76%，但功能不同；OCTN1与SLC22家族三个有机阳离子转运体（OCT）成员序列一致性低得多，却共享多选择性。鉴于约40%的药物为有机阳离子，SLC22家族成员OCTs（OCT1、OCT2和OCT3）与OCTN1对药物递送和相互作用具有重要意义。国际转运体联盟（ITC）、美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）建议检测OCTs以预测药物/药物相互作用（DDIs）。OCTN1已被认定为高亲和力麦角硫因和低亲和力肉碱转运体；更重要的是，其能够从人细胞系及体外实验系统中释放ACh，因而被视为NNCS中负责ACh释放的组分，该通路参与增殖、分化和炎症。部分人癌细胞表达NNCS全部组分。近期肺癌细胞（A549）来源OCTN1蛋白的转运实验证实其具备ACh释放能力，提示抑制肿瘤中运行的胆碱能通路可能成为新的抗癌策略。以OCT3三维结构为模板通过同源建模构建的OCTN1结构模型已被用于揭示其配体结合偏好，计算分析鉴定奎尼丁和维拉帕米为结合物，但计算机模拟方法需经湿实验验证。基于预测的相互作用，研究人员在蛋白脂质体系统中通过功能实验验证了奎尼丁和维拉帕米对ACh转运的作用，该系统可在无干扰环境中研究重组hOCTN1或A549 hOCTN1的转运活性，从而获得抑制特征与机制信息。通过该方法，除表征抑制作用外，还发现trans-抑制效应，这对通过外源性给药药物削弱ACh释放具有潜在重要意义。

研究背景：有机阳离子转运体新型成员1（OCTN1，Organic Cation Transporter Novel 1）是SLC22家族的膜转运蛋白，与OCTN2构成SLC22A4/SLC22A5小亚组，二者序列一致性超过76%但功能不同；OCTN1与SLC22家族OCT1、OCT2、OCT3序列一致性较低，却共享多选择性。约40%的药物为有机阳离子，因此SLC22家族成员对药物递送与药物/药物相互作用（DDIs）至关重要，国际转运体联盟（ITC）、美国食品药品监督管理局（FDA）与欧洲药品管理局（EMA）建议检测OCTs以预测DDIs。OCTN1已被认定为高亲和力麦角硫因与低亲和力肉碱转运体，并能从人细胞系和体外系统中释放乙酰胆碱（ACh），被视为非神经元胆碱能系统（NNCS）中负责ACh释放的组分，该通路参与增殖、分化与炎症。部分人癌细胞表达NNCS全部组分，A549肺癌细胞来源OCTN1蛋白已被证实具备ACh释放能力，肿瘤中ACh可诱导增殖、上皮-间质转化（EMT）、迁移与侵袭，故抑制肿瘤胆碱能通路可能成为新的抗癌策略。以OCT3三维结构为模板的同源建模已用于揭示OCTN1配体结合偏好，计算分析鉴定奎尼丁与维拉帕米为结合物，但计算机模拟结果需湿实验验证，且FDA与EMA指南亦要求确认抑制剂或调节剂活性。基于此，研究人员在蛋白脂质体系统中验证上述两药对ACh转运的作用，该系统可在无干扰环境中研究重组hOCTN1或A549来源hOCTN1的转运活性，以获取抑制特征与机制信息。

研究开展与结论：研究人员以分子对接预测为起点，结合蛋白脂质体转运实验，验证了奎尼丁与维拉帕米为hOCTN1的有效抑制剂，揭示二者对ACh摄取呈混合型抑制，并首次发现其对ACh外排的trans-抑制效应；同时通过洗脱实验表明OCTN1几乎不能转运这两种药物。重要意义在于：该蛋白脂质体实验可作为鉴定与表征OCTN1抑制剂的可靠概念验证平台，而trans-抑制机制为通过外源性药物调控NNCS、尤其是靶向肿瘤胆碱能信号提供了依据，并为筛选更高亲和力分子奠定基础。

关键技术方法（不超过250字）：采用Lemo21(DE3)大肠杆菌表达并纯化重组hOCTN1，经去垢剂增溶与Ni²⁺亲和层析后，以批次法将重组蛋白或A549细胞膜提取物重建入含大豆磷脂与胆固醇的脂质体，形成蛋白脂质体；以[³H]ACh进行摄取与外排转运测定，用Sephadex G-75凝胶过滤分离脂质体并液体闪烁计数；通过剂量-反应曲线求IC₅₀，以Michaelis–Menten模型非线性回归及Lineweaver–Burk双倒数作图判别抑制类型并求K_i；采用冷药物洗脱实验评估trans-抑制与药物转运能力，并以无OCTN1脂质体检测ACh泄漏以评估膜完整性。样本来源为A549细胞系（由Dr. Daniela Gaglio, CNR-IBFM, Milan惠赠）。

研究结果：

3.1 预测抑制剂对hOCTN1的作用：通过在蛋白脂质体中测定1 mM各化合物存在下0.1 mM [³H]ACh的摄取，发现除阿糖胞苷、加巴喷丁和5-氟尿嘧啶外其余化合物均显著抑制摄取；奎尼丁与维拉帕米抑制最强，异丙托溴铵与二甲双胍约抑制60%，5-氟尿嘧啶约20%。脂质体完整性对照显示各浓度下均无内部放射性释放，仅15 mM维拉帕米引起约20%释放，提示膜轻微破坏。剂量-反应分析显示，奎尼丁IC₅₀对重组蛋白为0.20 ± 0.011 mM、对A549来源蛋白为0.57 ± 0.19 mM；维拉帕米相应为0.21 ± 0.027 mM与0.53 ± 0.19 mM。

3.2 奎尼丁与维拉帕米的抑制动力学：通过在不同ACh浓度与不同抑制剂浓度下测定转运速率并作Lineweaver–Burk双倒数图，直线交点不位于X轴或Y轴，表明二者均为混合型抑制；奎尼丁与维拉帕米的K_i分别为0.15 ± 0.037 mM与0.18 ± 0.063 mM，低于相应IC₅₀，符合竞争性或混合型抑制的预期，K_i被视为定义转运体对两药亲和力的最佳参数。

3.3 hOCTN1的trans-抑制分析：将载有0.1 mM [³H]ACh的蛋白脂质体外加1 mM奎尼丁或维拉帕米，15分钟后测定外排抑制；奎尼丁对重组蛋白与A549蛋白的外排抑制分别为64.7 ± 21.7%与38.2 ± 14.8%，维拉帕米分别为24.2 ± 5.60%与3.29 ± 0.77%。冷药物洗脱实验显示，内含1或15 mM奎尼丁时重组蛋白的trans-抑制为19.0 ± 12.2%与27.6 ± 6.07%，细胞蛋白为33.4 ± 8.20%与63.6 ± 3.59%；内含1或15 mM维拉帕米时重组蛋白为21.0 ± 14.6%与54.2 ± 10.6%，细胞蛋白为6.51 ± 14.1%与70.4 ± 11.6%（后者可能因维拉帕米对脂质体完整性的影响而略被高估）。作为对照，内含15 mM TEA几乎无影响，表明两药不能被OCTN1有效转运而在囊泡内滞留并部分阻断转运体。trans-抑制的IC₅₀粗略估计约为10 mM，高于外侧IC₅₀，可能源于转运体内外侧结构的不对称性。

讨论总结：以计算筛选起始、实验验证收尾是鉴定分子靶标配体的公认流程；由于靶标无三维解析结构，研究人员利用可靠的OCTN1三维模型开展对接预测，并以重组hOCTN1蛋白脂质体系统验证。四种高分预测化合物中维拉帕米、奎尼丁与异丙托溴铵呈强抑制，低分化合物二甲双胍与5-氟尿嘧啶呈轻度抑制；阿糖胞苷虽对接评分最高却几乎无抑制，可能因其pK为酸性（pK 4.2），在接近生理pH的实验条件下不带正电荷，且与既往其转运不受TEA或麦角硫因抑制的数据一致。研究人员进一步表征两种强抑制剂：维拉帕米为L型电压门控Ca²⁺（Cav）通道相互作用药物，近期还被证明可抑制H1N1流感病毒复制并缓解炎症反应；奎尼丁为Ia类抗心律失常药，具多种蛋白阻断的多效性，并早已被确立为α₁与α₂肾上腺素受体及CYP2D6的强竞争性抑制剂；二者此前已被证明是包括OCTN1在内的SLC22家族多个成员的广谱抑制剂，但机制未明。本研究发现二者呈混合型抑制，不同于其主要靶标上多为竞争性抑制，提示底物与抑制剂结合位点不完全重叠，与计算数据中部分残基共同作用于ACh、奎尼丁与维拉帕米而另一些仅参与两药结合的预测相符；该混合型抑制亦不同于既往麦角硫因转运中的竞争性抑制，可用有机阳离子与麦角硫因、肉碱转运路径不同来解释。最突出的新发现是两药对ACh转运的trans-抑制，虽发生于较高抑制剂浓度，但鉴于OCTN1公认的生理作用具有重要意义；既往在完整细胞模型与体外模型中已证明外部Na⁺不抑制外排过程，据此提出OCTN1的主要生理作用是在NNCS框架内介导ACh外排，该系统通过自分泌或旁分泌信号调控增殖、分化、迁移与免疫反应等基本细胞过程，因此以外部添加化合物抑制ACh释放可能成为干预NNCS、特别是抑制其在肿瘤等人类疾病中作用的基础。蛋白脂质体模型中转运蛋白插入方向与细胞中一致，使结果可外推至体内情境；洗脱实验显示OCTN1不能或极少转运抑制剂，支持两药使转运体停留在无法完成转运循环构象变化的抑制剂结合状态；细胞来源蛋白抑制效应的差异可能归因于细胞调节因子（如磷脂）或翻译后修饰的影响。研究结论：本研究描述了一种ACh外排trans-抑制的新机制，鉴于OCTN1在NNCS中介导ACh释放的拟议作用而尤为重要；研究人员认识到两抑制剂的K_i值较其在生物体液中的浓度约高一个数量级，但结果构成了对该抑制机制的概念验证，该机制对更高亲和力新分子的作用至关重要并具潜在治疗应用价值；因此，对维拉帕米与奎尼丁等已知抑制剂的研究是鉴定类似（或更复杂）更高效率分子的起点，经血流分布于各组织、与转运体外侧面相互作用的配体将在调控正常细胞与肿瘤细胞中OCTN1依赖的胆碱能通路方面发挥关键作用；所采用的方法可实现与OCTN1相互作用分子（底物或抑制剂）的高可靠、快速鉴定。