壁面剪切应力影响伯氏疏螺旋体在三维组织工程微血管模型中的黏附与外渗

《Microbiology Spectrum》：Wall shear stress influences adhesion and extravasation of Borrelia burgdorferi in a 3D tissue-engineered microvascular model

　　

莱姆病是一种主要由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi, Bb）引起的蜱传疾病。蜱虫叮咬后，Bb被注入真皮层并在局部组织中定殖，随后可通过血管系统播散至远处器官。尽管播散是疾病进展的关键因素，但目前对影响Bb经血液循环播散的机制和因素的了解仍不完整。为评估壁面剪切应力（wall shear stress, WSS）对Bb黏附和外渗的作用，研究人员在不同壁面剪切应力下，将荧光标记的Bb灌注到三维组织工程微血管模型中。Bb从微血管中的黏附和外渗速率强烈依赖于WSS。Bb以细长形态黏附于内皮，偶尔会出现“翻转”事件，即Bb的一端锚定，另一端脱落并在下游重新附着。最后，循环中的Bb在6小时灌注后并未诱导内皮激活，但在低WSS下增加的微血管通透性与增加的Bb黏附事件相关。这些结果为研究Bb播散提供了一种新方法，并为理解Bb外渗机制提供了新见解。

研究背景与目的

莱姆病是由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi, Bb）引起的主要蜱传疾病，在美国占所有报告蜱传疾病的82%。Bb从叮咬部位播散可导致远端组织和器官感染，引发莱姆关节炎、心肌炎或神经疏螺旋体病等组织特异性疾病。尽管播散在疾病进展中至关重要，但入侵、内渗和外渗是复杂的过程，许多机制细节仍未阐明。既往研究表明，壁面剪切应力（wall shear stress, WSS）可能在播散中发挥重要作用。因此，本研究旨在利用三维组织工程微血管模型，评估不同生理水平WSS对Bb在内皮上黏附与外渗动力学的影响。

研究方法概述

研究人员利用由诱导多能干细胞（iPSCs）分化而来的非组织特异性诱导内皮细胞（iECs），接种于I型胶原基质中直径150 μm的通道内，形成融合的单层微血管。将绿色荧光蛋白（GFP）标记的Bb（B31-A3菌株）以5 × 10⁶ mL^-1浓度，在分别对应毛细血管后微静脉（1和3 dyne cm^-2）和动脉（10 dyne cm^-2）生理范围的三种WSS下进行灌注。通过共聚焦显微镜在赤道面实时成像，每4秒采集一帧，持续6小时，记录Bb-内皮相互作用。

研究结果

Borrelia burgdorferi（Bb）与诱导内皮细胞（iEC）的相互作用

研究人员观察到Bb与内皮之间存在三种结局：从内皮脱落、外渗至周围细胞外基质（ECM），以及未知命运（在成像结束时仍保持黏附）。黏附事件定义为Bb附着内皮至少两帧（8秒）。外渗事件定义为Bb黏附后穿过内皮进入ECM。

壁面剪切应力对Bb-iEC相互作用的影响

Bb的累积黏附事件数随时间线性增加（线性回归分析，P < 0.0001），并强烈依赖于WSS。在1 dyne cm^-2下，6小时后每毫米微血管平均发生137.4 ± 43.37次黏附事件；在3 dyne cm^-2下降至20.6 ± 7.31 mm^-1；在10 dyne cm^-2下降至11.6 ± 4.22 mm^-1。外渗事件仅在最低WSS（1 dyne cm^-2）下被观察到，累积数量随时间线性增加至6.4 ± 2.4 mm^-1。Bb在内皮上的平均停留时间也依赖WSS，从1 dyne cm^-2下的3356 ± 3893秒显著降低至10 dyne cm^-2下的374.8 ± 1129秒（P < 0.001）。在1 dyne cm^-2下，导致外渗的黏附事件的停留时间（4947 ± 3895秒）显著长于导致脱落的停留时间（3141 ± 3851秒）（P < 0.001）。

Bb沿内皮的迁移

黏附后的Bb呈细长形态，沿微血管轴向排列，处于静止状态或沿流动方向迁移。研究人员观察到“翻转”事件：Bb的后端（上游端）脱落，随后在下游重新附着成为前端，而另一端仍锚定在内皮上。翻转过程的平均完成时间为5.00 ± 3.74分钟，事件间间隔为26.8 ± 25.4分钟。Bb沿内皮迁移的平均速度为1.51 ± 0.49 μm min^-1。所有这些迁移和翻转事件仅在1 dyne cm^-2下被记录到。

Bb对内皮激活和屏障功能的影响

免疫染色显示，在所有WSS条件下，灌注Bb 6小时后，内皮细胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达与对照组无显著差异。单核细胞样细胞（THP-1）和中性粒细胞样细胞（HL-60）的黏附数量在Bb灌注组与对照组之间也无统计学差异。在3和10 dyne cm^-2下，Bb灌注后微血管对2 MDa葡聚糖的通透性无显著变化。然而，在1 dyne cm^-2下，Bb灌注组的通透性显著高于对照组，表明屏障功能障碍与高黏附事件相关。

讨论与结论总结

研究人员利用组织工程iEC微血管模型研究了WSS如何影响Bb与内皮的相互作用。讨论部分指出，Bb播散是一个多步骤过程，本研究结果与体内实验（IVM）一致，即外渗优先发生在低WSS的毛细血管后微静脉。研究还发现，外渗率相对于黏附的Bb数量符合一级动力学。此外，尽管使用了高浓度Bb，但未检测到内皮激活，这与静态条件下的体外研究结果不同，可能归因于流动条件减少了Bb-内皮接触。屏障功能障碍仅在低WSS下显著，暗示其由Bb的瞬时附着所诱导。

研究结论翻译如下：

(i) 灌注期间，Bb瞬时黏附于内皮，随后脱落或外渗至周围细胞外基质。

(ii) 黏附事件数随时间线性增加，附着率随WSS降低而升高，表明WSS在黏附中起关键作用。Bb在内皮上的停留时间随WSS降低而增加。黏附导致脱落的可能性比外渗高约7倍，且脱落事件的停留时间显著短于外渗事件。

(iii) 仅在最低WSS下观察到外渗事件。外渗率在6小时灌注期间保持恒定，表明外渗是一个依赖于黏附Bb数量的一级过程。

(iv) 黏附的Bb通常呈细长状并沿流动方向排列，不表现出静态或ECM中“游泳”时的螺旋形态。黏附的Bb有时静止，有时沿管腔以1.5 μm min^-1的平均速度向流动方向迁移。

(v) 黏附的Bb表现出“翻转”事件，其后端脱落并在下游重新附着成为前端，而另一端仍锚定于内皮，表明Bb两端均锚定于内皮，WSS可脱落上游端。

(vi) 灌注Bb未导致黏附分子ICAM-1或VCAM-1表达的变化，也未改变免疫细胞的黏附。然而，在低WSS下灌注Bb导致微血管通透性增加，这与高黏附事件数相关，表明屏障功能障碍由Bb对内皮的瞬时附着诱导。