《Microbiology Spectrum》：Introducing SARS-CoV-2 wastewater surveillance in Lebanon
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废水监测（WWS）在COVID-19大流行期间作为持续监测SARS-CoV-2及其演化变异的早期预警系统而受到全球关注。本研究旨在检测并测序来自黎巴嫩一个收容弱势黎巴嫩居民和难民地区的废水中的SARS-CoV-2。2023年2月20日至2023年5月31日期间
废水监测（WWS）在COVID-19大流行期间作为持续监测SARS-CoV-2及其演化变异的早期预警系统而受到全球关注。本研究旨在检测并测序来自黎巴嫩一个收容弱势黎巴嫩居民和难民地区的废水中的SARS-CoV-2。2023年2月20日至2023年5月31日期间，从18个检查井采集了188份废水样本。研究人员进行了病毒RNA提取、RT-PCR和基因组测序。18%的采集样本为SARS-CoV-2阳性。Omicron BA.2是2月份唯一 circulating 的变异株。3月份检测到Omicron BA.2（33.33%）与B.1.1样亚谱系（包括C.26（16.67%）、B.1.1.207（16.67%）、B.1.1.214（16.67%）和C.2.1（16.67%））的重叠。4月份，Omicroncirculation降至12.5%，同时检测到BA.1和BA.2重组体（XM）。缺乏研究地点居民的分组数据集和病例特异性SARS-CoV-2报告限制了研究人员进行废水与国家临床数据之间相关性和比较分析的能力。然而，废水样本在大多数月份中显示比国家病例激增更高的阳性率。这些发现强调了将废水监测（WWS）纳入公共卫生干预措施以补充临床和流行病学监测的重要性。废水监测（WWS）是一种有价值的环境监测工具，有助于实时检测circulating病毒和新出现的变异株。COVID-19大流行显著加速了WWS作为检测SARS-CoV-2和监测社区传播的早期预警系统的使用。这是首次在黎巴嫩引入基于社区的SARS-CoV-2废水监测（WWS）的研究。本研究结果强调了在资源有限的环境中实施WWS以补充流行病学监测、在人群/社区层面监测SARS-CoV-2趋势的重要性和可行性。
研究背景：废水监测（WWS），又称基于废水的流行病学，是一种环境监测方法，能够实时检测circulating病毒和新出现的变异株，作为潜在流行威胁的早期预警系统。SARS-CoV-2 RNA片段在有症状和无症状患者的粪便中均有排出，排出持续时间因变异类型、年龄、性别、疫苗接种状态和既往合并症等因素而异。粪便中检测到SARS-CoV-2比临床症状出现早3-5天，且在症状清除后至少持续2周。此外，废水中SARS-CoV-2的检测已被报道可预测住院情况1至4周。因此，WWS补充了临床监测，具有可扩展性、较低成本以及能够绕过临床监测固有偏倚等优势。COVID-19大流行显著加速了WWS作为早期预警系统的使用，WWS已被用于追踪circulating SARS-CoV-2变异株。WWS已整合到荷兰、丹麦、加拿大、美国、南非和印度等国的国家监测系统中，在低收入和中等收入国家使用有限。黎巴嫩是东地中海区域（EMR）的一个小国，估计人口590万，人均难民人数全球最高。黎巴嫩面临现代史上最严重的经济和金融危机，削弱了其本已脆弱的私有化医疗系统，限制了监测、数据共享和诊断检测所需资源的可用性。黎巴嫩也缺乏基因组WWS系统以及分散的卫生信息学，影响了数据可用性和及时共享以支持知情的公共卫生决策。本研究旨在检测并测序来自黎巴嫩一个收容弱势黎巴嫩居民和难民地区的原始废水中的SARS-CoV-2，以评估基于社区的病毒circulation。据研究人员所知，这是首次在黎巴嫩引入基于社区的SARS-CoV-2废水监测的研究。
研究人员开展的研究及结论：研究人员在2023年2月20日至2023年5月31日期间，从黎巴嫩Sin El Fil地区的18个检查井采集了188份废水样本。研究人员进行了病毒RNA提取、RT-PCR和基因组测序。结果显示，18%的样本为SARS-CoV-2阳性。月度阳性率从2月的7.4%急剧上升至3月的19.35%，4月达到峰值25%，5月逐渐下降至15.15%。系统发育分析显示circulating变异株遗传多样性有限，SARS-CoV-2聚类为三个主要分支：20B、20D和21L。Omicron BA.2是2月份唯一检测到的变异株。3月份检测到Omicron BA.2（33.33%）与B.1.1样亚谱系（C.26、B.1.1.207、B.1.1.214和C.2.1各占16.67%）的重叠。4月份Omicron降至12.5%，同时出现BA.1和BA.2重组体（XM）以及B.1.1样亚谱系（AD.2、N.9、B.1.1.161、P.4、B.1.1.214、B.1.1.519和C.2.1）共检出。5月份仅检测到B.1.1.519和C.2.1。双变量分析显示废水样本中circulating SARS-CoV-2变异株（Fisher精确检验P值=0.009）或其亚谱系（Fisher精确检验P值=0.02）与样本采集日期之间存在显著关联。谱系B.1.1.519最为流行（43%），其次为C.2.1（14%）、BA.2（14%）和B.1.1.214（8.5%）。研究人员进行了Spearman相关分析以确定SARS-CoV-2阳性废水样本数与全国确诊病例之间的关系，数据显示临床病例数与废水阳性样本数之间无统计学显著相关性（Spearman's rho = ?0.0939；P值=0.67），国家阳性率与废水阳性率之间也无统计学显著相关性（Spearman's rho = ?0.4；P值=0.6）。然而，废水样本在研究期间大多数月份中显示比国家病例激增更高的阳性率。研究期间三个月后（2023年6月至8月），临床病例出现激增，阳性率从6月的3.2%上升至8月的18.1%，与废水样本的阳性率范围一致。这些发现强调了将WWS纳入公共卫生干预措施以补充临床和流行病学监测的重要性。本研究的重要意义在于首次在黎巴嫩引入基于社区的SARS-CoV-2废水监测，证明了在资源有限的环境中实施WWS以补充流行病学监测、在人群/社区层面监测SARS-CoV-2趋势的重要性和可行性。
关键技术方法：研究人员采用抓取采样法每周一次从18个检查井采集废水样本（每次连续采集5份100-250 mL样本，间隔30分钟，混合为一份复合样本），共计188份复合样本。使用氯化铝沉淀结合超速离心法进行病毒浓缩，采用AllPrep Viral DNA/RNA试剂盒进行病毒RNA提取。通过RT-PCR检测SARS-CoV-2的ORF1ab、N和E基因（使用Maccura SARS-CoV-2荧光PCR试剂盒和ANDiS FAST SARS-CoV-2 RT-qPCR检测试剂盒）。阳性样本使用Illumina COVIDSeq Assay试剂盒和ARTIC V4 NCOV2019 Panel引物进行基因组测序，在Illumina MiSeq平台上完成测序。使用Nextclade进行变异株指派，Pangolin（v0.1.12）进行PANGO谱系指派。系统发育分析采用MAFFT version 7进行序列比对，PhyML软件利用GTR核苷酸替换模型和100次bootstrap分析构建系统发育树，通过iTOL网络工具进行可视化和注释。统计分析使用STATA SE 13.0，采用Fisher精确检验评估变异株/亚谱系与采样日期之间的关联，Spearman相关分析评估废水数据与国家临床数据之间的相关性。
研究结果：
Detection of SARS-CoV-2 genes（SARS-CoV-2基因检测）：在188份废水样本中，34份（18%）为SARS-CoV-2阳性。月度阳性率从2月的7.4%急剧上升至3月的19.35%，4月达到峰值25%，5月逐渐下降至15.15%。国家数据报告的最高月度阳性率出现在2月（10.68%），其次为3月（7.86%）、4月（7.6%）和5月（6.66%）。通过Spearman相关分析，研究人员发现临床病例数与废水阳性样本数之间无统计学显著相关性（Spearman's rho = ?0.0939；P值=0.67），国家阳性率与废水阳性率之间也无统计学显著相关性（Spearman's rho = ?0.4；P值=0.6）。国家临床病例在绝对数量和阳性率上呈下降趋势，而Sin El Fil废水样本在同一时期呈相反趋势。
Distribution of SARS-CoV-2 variants and sublineages（SARS-CoV-2变异株和亚谱系分布）：系统发育分析显示circulating变异株遗传多样性有限，SARS-CoV-2聚类为三个主要分支：20B、20D和21L，样本间系统发育关系密切。这种遗传相似性表明B.1.1样变异株及其亚谱系（主要为B.1.1.519）以及Omicron亚变异株（特别是BA.2和BA.1样变异株）占主导地位。Omicron BA.2是2月份唯一检测到的变异株。3月份检测到Omicron BA.2（33.33%）与B.1.1样亚谱系（C.26、B.1.1.207、B.1.1.214和C.2.1各占16.67%）的重叠。2023年4月标志着Omicron变异株降至12.5%，同时出现BA.1和BA.2重组体（XM）以及B.1.1样亚谱系（AD.2、N.9、B.1.1.161、P.4、B.1.1.214、B.1.1.519和C.2.1）共检出。5月份仅检测到B.1.1.519和C.2.1。双变量分析显示废水样本中circulating SARS-CoV-2变异株（Fisher精确检验P值=0.009）或其亚谱系（Fisher精确检验P值=0.02）与样本采集日期之间存在显著关联。这些发现表明SARS-CoV-2变异株及其亚谱系的时间演化。谱系B.1.1.519最为流行（43%），其次为C.2.1（14%）、BA.2（14%）和B.1.1.214（8.5%），其余谱系包括B.1.207、C.26、P.4、AD.2、B.1.161、XM和N.9以较低频率（各3%）检测到。
讨论部分总结：WWS在COVID-19大流行期间作为持续检测和监测SARS-CoV-2及其演化变异的早期预警系统而受到全球关注。黎巴嫩作为中低收入国家，基因组监测基础设施有限，缺乏SARS-CoV-2及其他病原体的WWS系统。本研究推进了黎巴嫩首个基于社区的SARS-CoV-2 WWS系统。WWS是一种成本效益高的方法，补充临床检测以监测病毒流行率和预测病毒趋势，特别是在获得医疗服务和检测有限的弱势社区中。废水中SARS-CoV-2 RNA的检测表明存在既往或活跃的SARS-CoV-2感染。研究人员的结果显示Sin El Fil采集的样本中18%为SARS-CoV-2阳性。Sin El Fil的废水阳性率高于同期国家临床病例的平均阳性率。研究期间三个月后，临床病例出现激增，阳性率从2023年6月的3.2%上升至8月的18.1%，与废水样本的阳性率范围一致。研究人员的数据显示Sin El Fil废水样本中SARS-CoV-2阳性率与国家COVID-19确诊病例之间无显著关联，这是由于缺乏与废水数据直接可比的地区分组临床数据。研究人员还承认缺乏全国代表性的废水样本，因此数据应谨慎解读。本研究观察到的阳性率低于埃塞俄比亚、印度和意大利的废水研究，与美国、德国和捷克共和国的研究报告相比有高有低。阳性率差异可能归因于SARS-CoV-2粪便排出的个体差异、废水采样频率、环境条件导致的病毒RNA降解、降雨和稀释导致的信号强度变异、人口规模和下水道覆盖范围、不同个体和变异株的病毒排出差异以及实验室方法。研究人员样本中检测到的关键变异株为Omicron BA.2和BA.1变异株以及B.1.1样变异株及其亚谱系，这些发现与黎巴嫩先前进行的临床基因组研究一致。B.1.1样变异株（主要为B.1.1.519）的持续出现可能提示 prolonged 粪便排出或废水中SARS-CoV-2 RNA片段的长期存在。研究人员的结果还显示circulating变异株与样本采集日期之间存在显著相关性，这与区域和全球趋势一致。本研究存在若干局限性，包括依赖国家临床和流行病学数据而非Sin El Fil当地数据进行相关性分析、样本采集时间短、缺乏病毒定量、检查井堵塞导致可用检查井数量减少以及无法应用预测模型。本研究强调了WWS作为成本效益高的工具补充临床和流行病学监测以监测社区病毒circulation趋势的重要性和可行性，这在监测系统薄弱或脆弱且资源有限的环境（如黎巴嫩）中尤为关键。将WWS扩大至国家和区域层面对于捕获更大的汇水区域（包括城市地区、农村社区和冲突环境中的非正式定居点）非常重要。将WWS扩大规模并整合到现有的脆弱国家监测系统中，将有助于早期发现疫情暴发并填补与临床检测和卫生服务获取有限人群缺乏临床数据相关的缺口。在黎巴嫩和资源有限的国家，政府可以利用研究实验室和机构的知识专长和技术能力来支持国家层面WWS的实施。WWS的实施将提供一种高效、非侵入性的早期预警工具，补充SARS-CoV-2和其他病原体的临床监测。
研究结论翻译：本研究将SARS-CoV-2废水监测引入黎巴嫩。尽管其在该国具有原创性，但本研究包含若干局限性，包括依赖国家临床和流行病学数据而非Sin El Fil当地数据与废水数据进行相关性分析，这是由于缺乏Sin El Fil居民的分组数据集和病例特异性SARS-CoV-2报告，限制了研究人员进行废水与临床数据之间相关性和比较分析的能力。此外，废水数据的解读受到样本采集时间短和缺乏病毒定量的限制，因此无法就时间变异和环境因素（如降雨和废水稀释）导致的病毒信号强度变异性、人口规模和下水道网络覆盖差异以及感染者病毒排出异质性得出结论。检查井堵塞是另一个局限性，导致可用于样本采集的检查井数量减少。无法定量病毒RNA和应用预测模型也是一个局限性，原因是缺乏关于确切人口规模、每升基因拷贝数、每日流量、Sin El Fil病例数以及估计Sin El Fil社区内感染人数所需的定量指标数据。本研究强调了WWS作为成本效益高的工具补充临床和流行病学监测以监测社区病毒circulation趋势的重要性和可行性；这在监测系统薄弱或脆弱且资源有限的环境（如黎巴嫩）中尤为关键。将WWS扩大至国家和区域层面对捕获更大的汇水区域（包括城市地区、农村社区和冲突环境中的非正式定居点）非常重要。此外，指导有针对性的国家公共卫生干预和应对策略以应对当前和未来威胁至关重要。将WWS扩大规模并整合到现有的脆弱国家监测系统中，将有助于早期发现疫情暴发并填补与临床检测和卫生服务获取有限人群缺乏临床数据相关的缺口。在黎巴嫩和资源有限的国家，政府可以利用研究实验室和机构的知识专长和技术能力来支持国家层面WWS的实施。WWS的实施将提供一种高效、非侵入性的早期预警工具，补充SARS-CoV-2和其他病原体的临床监测。
