全长休眠促进因子（HPF）的整合结构与功能分析及其与耻垢分枝杆菌抗生素敏感性的关联

《Microbiology Spectrum》：Integrative structural and functional analysis of full-length hibernation-promoting factor and its association with antibiotic susceptibility in Mycobacterium smegmatis

　　

核糖体休眠是一种关键的适应性机制，使细菌能够通过稳定失活核糖体并节约细胞资源在应激条件下存活。该过程由休眠促进因子（HPF）介导。然而，对耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）HPF全长结构及其C端区域的结构与功能认识仍然有限。本研究结合计算模拟（in silico）与实验方法，对耻垢分枝杆菌HPF（MSMEG_1878）进行表征，并探讨其在核糖体相关生理功能及抗生素应答中的作用。序列与系统发育分析显示，HPF在分枝杆菌属物种间高度保守，包括延长的C端区域。采用互补建模策略并经分子动力学优化的全长230个氨基酸结构模型与实验解析区域高度吻合。结构定位显示HPF位于70S核糖体亚基间界面，其建模C端区域延伸至16S rRNA解码中心附近。对接分析预测，巴龙霉素与新霉素定位于h44相关解码中心区域、邻近HPF相关表面，而氯霉素与四环素定位于空间上不同的核糖体区域。hpf缺失损害细菌生长并降低对巴龙霉素和新霉素的敏感性，而互补回补使敏感性恢复至野生型表型。此外，新霉素暴露显著增加hpf转录本丰度，而巴龙霉素暴露呈非显著升高趋势。综上，这些发现提示耻垢分枝杆菌HPF参与核糖体相关生理功能，并可能影响细胞对特定抗生素的应答，为理解分枝杆菌中核糖体休眠与抗生素应答的关系提供了线索。

研究背景 结核病（TB）仍是单一感染性病原体致死的主要原因，据WHO《2025年全球结核病报告》，2024年全球有1070万人罹患结核病、123万人死亡。结核病防控的主要障碍在于结核分枝杆菌（Mtb）能够进入休眠或非复制状态，在宿主体内不利条件下存活、逃避免疫清除，并对多种抗生素敏感性降低；免疫受损个体中休眠菌复苏常导致活动性疾病与持续传播。核糖体休眠是分枝杆菌持续感染中一个研究不足的决定因素，可在休眠期保存核糖体，对休眠菌存活与复苏至关重要。尽管核糖体休眠在细菌中广泛存在，但相关因子与机制因物种而异。在耻垢分枝杆菌（Msm）中，HPF与70S核糖体结合并在应激条件下促进核糖体休眠，冷冻电镜研究显示Msm-HPF结合于30S亚基mRNA通道、与A位和P位tRNA结合位点重叠，从而稳定失活状态核糖体；但Msm-HPF的全长结构仍未解析。已有结构研究提示HPF结合于mRNA通道与解码中心等功能重要区域附近，而这些区域亦为部分抗生素的靶点，其空间邻近性提示HPF可能影响抗生素-核糖体相互作用或抗生素结合位点的局部可及性。Msm作为非致病、快速生长的分枝杆菌生理研究模式生物，为研究HPF相关功能与调控机制提供了机会，且其对理解依赖类似应激应答机制维持持续感染的致病性分枝杆菌具有参考价值。基于此，研究人员开展了整合结构与功能分析。

主要技术方法 研究采用生物信息学序列与系统发育分析及保守基序（MEME）分析；利用I-TASSER、AlphaFold、SWISS-MODEL与Robetta多平台进行全长结构建模，并以PROCHECK、ERRAT、VERIFY-3D、ProSA及Ramachandran图进行模型验证，结合50 ns分子动力学模拟优化；将模型映射至Msm 70S核糖体冷冻电镜结构（PDB ID: 5ZEP）并进行分子对接（LibDock）；构建MSMEG_1878基因敲除株（Δhpf）与回补株（Δhpf/hpf），开展菌落形态、生长曲线、倍增时间、纸片扩散法、最小抑菌浓度（MIC）、相对生长及qRT-PCR检测。

研究结果 基于一级序列的分析：CDD分析将Msm-HPF归入YfiA/RaiA超家族，鉴定出覆盖31–131位残基的YfiA/RaiA结构域（TIGR00741）及覆盖174–226位残基的C端Sigma-54（σ⁵⁴）调节/S30EA核糖体蛋白相关结构域（pfam16321/cl24782），分别约占全长230残基蛋白的43.9%与23.0%。多序列比对显示所有分枝杆菌HPF均具N端延伸，全长约210–230个氨基酸，长于其他细菌典型长型HPF（约180–190个氨基酸）及变形菌短型HPF（约90个氨基酸）；Msm与致病性分枝杆菌在核心结构域和C端区域高度保守。系统发育分析显示分枝杆菌HPF同源物形成支持度100的独立进化支，Msm与M. marinum最为接近。MEME鉴定出20个保守基序，其中6个最显著基序E值极低（6.7 × 10^?166至3.2 × 10^?11）；N端基序主要与RaiA结构域相关，C端多个高度保守基序与Ribosome_S30AE_C结构域重叠，而C端基序在非分枝杆菌短型HPF中大多缺失。基序1、2、3、4、6在全部分枝杆菌HPF中保守，支持Msm作为研究HPF介导抗生素敏感性调控的合适模式生物。

二级结构预测与分析：PSIPRED与PDBsum分析显示Msm-HPF以β-链为主并散布短α-螺旋，鉴定出三个主要α-螺旋区（H1：44–60，H2：106–130，H3：188–197位氨基酸），主要位于蛋白中部与C端。DISOPRED3显示大部分序列有序，仅在C端片段（128–168位氨基酸）附近存在短的无序区，C端无序区多于N端。ProtParam计算得不稳定指数37.89、GRAVY值?0.79，提示蛋白稳定且具亲水性。

Msm-HPF的分子建模与验证：多平台建模后各模型最适区残基比例约82%–95%。AlphaFold逐残基pLDDT与预测比对误差图显示C端区域（131–230位残基）局部置信度较低、位置不确定性较大。I-TASSER模型Ramachandran最适区比例最高（95.1%），AlphaFold模型ERRAT得分最高（96.47），Robetta模型Verify3D得分最佳（70.43）；综合评估后选择I-TASSER模型作为代表性结构。50 ns分子动力学模拟显示RMSD初期上升后趋于相对稳定，SASA与回旋半径逐渐降低提示结构压缩，RMSF显示末端与环区柔性较高而核心二级结构较稳定。精修模型ProSA Z评分为?5.7，处于同等大小实验结构范围内；与已解析的部分HPF结构（PDB ID: 5ZEP）叠合RMSD为2.279 ?。PDBsum显示模型约含30% α-螺旋、25% β-折叠与44%无规卷曲；ERRAT得分70.72，VERIFY-3D显示86.09%残基平均3D-1D得分≥0.1。Mtb HPF模型ERRAT得分88.35、83.18%残基达标，两者叠合RMSD仅0.943 ?，提示高度结构保守与可能的功能等效。

休眠促进因子的结构定位：结构映射显示HPF位于30S与50S亚基间界面，桥接两亚基并向30S解码中心延伸，与16S rRNA的h27、h31、h34、h44、h45及23S rRNA的H69邻近；其中h44、h45与H69构成关键互作枢纽。h44为A位核心及氨基糖苷类主要结合位点，H69参与亚基间桥形成与核糖体稳定性。由于5ZEP仅解析31–130位残基，研究人员建模了全长1–230位残基结构，纳入此前缺失的C端结构域，显示其向解码中心区域延伸；独立空间位阻分析未检测到建模C端区域与邻近rRNA间范德华重叠≥0.6 ?的原子对。研究人员指出该区域构象与定位基于计算建模，属推测性质，尚需高分辨率结构或生化实验验证。

HPF选择性调节解码中心的氨基糖苷类结合：对接分析预测巴龙霉素与新霉素占据h44相关解码中心区域，与HPF相关表面空间邻近，二者均与h44保守16S rRNA残基形成氢键与静电相互作用；新霉素LibDock得分（165.3）高于巴龙霉素（160.8）。两种氨基糖苷类占据由rRNA核苷酸C1386–A1391与C1474–U1482形成的延伸口袋，邻近HPF残基Lys53、Glu111、Ser112、Gln115、Asn164、Ala168、Glu169、His170、Thr210、Asp211、Arg212与Ala230；新霉素与rRNA碱基（C1387–G1393、C1474–U1482）及Glu111、Gln115、Asp211、Arg212、Ala230等残基形成多个氢键。相反，氯霉素定位于50S亚基肽酰转移酶中心，邻近23S rRNA核苷酸A2026、A2027、C2423、C2424、A2451、G2452、U2453及核糖体蛋白L2、L9、L28；四环素定位于30S亚基内邻近A965、G1053、C1054、C1195、U1196、G1197、G1198及核糖体蛋白S2、S3的位点，与HPF空间上不同。结果提示HPF可选择性调节靶向解码中心抗生素（尤其氨基糖苷类）的结合，而结合于空间不同区域的抗生素呈HPF非依赖模式。

耻垢分枝杆菌Δhpf与Δhpf/hpf菌株的构建：采用重组工程策略构建MSMEG_1878缺失突变株，PCR产物野生型为1,840 bp、敲除株为2,150 bp，经Sanger测序确认后电穿孔导入携带野生型hpf的质粒获得回补株并经PCR确认。

耻垢分枝杆菌hpf敲除株（Δhpf）表现生长缺陷与菌落变小：Δhpf菌落尺寸较野生型明显减小、脊纹清晰度降低，ImageJ定量证实菌落直径显著减小，回补后恢复至野生型水平。液体培养中Δhpf生长延迟、进入指数期减慢，倍增时间约3.8 h，长于野生型的约2.96 h，回补后接近野生型。

hpf缺失差异性调节耻垢分枝杆菌的抗生素敏感性：纸片扩散法显示Δhpf对巴龙霉素与新霉素抑菌圈持续缩小；MIC分析显示Δhpf对巴龙霉素（约69倍）与新霉素（约8倍）MIC显著升高，回补株恢复敏感性。四环素与氯霉素对Δhpf活性增强（抑菌圈增大、MIC降低），回补后基本逆转。靶向非核糖体过程的利福平、异烟肼与乙胺丁醇在各菌株间无显著差异。

hpf缺失降低耻垢分枝杆菌中氨基糖苷类介导的生长抑制：在巴龙霉素0.5与1 μg/mL及新霉素1与2 μg/mL下，Δhpf相对生长显著高于野生型，回补株显著降低并趋近野生型。氯霉素（0.4、0.8、1.6 μg/mL）与四环素（0.045、0.09、0.19 μg/mL）处理下Δhpf相对生长低于野生型，提示敏感性增加，回补后向野生型偏移但恢复程度随浓度而异。利福平（0.25与1 μg/mL）处理各菌株间无显著差异。qRT-PCR显示未处理条件下hpf表达12 h内稳定；巴龙霉素（0.09 μg/mL）使hpf表达渐进升高，12 h约达4.6倍但未达统计学显著（P = 0.051）；新霉素（0.19 μg/mL）诱导更强，12 h表达约升高7倍（P < 0.0001）；乙胺丁醇（0.09 μg/mL）未显著改变hpf表达。

讨论与结论 讨论部分指出，本研究对Msm-HPF进行了整合结构与功能表征，重点在于此前未解析的C端结构域，将HPF的认识拓展至核糖体稳定化的经典作用之外。序列与系统发育分析支持Msm-HPF作为研究分枝杆菌核糖体相关应激应答的模式；与经典促进100S核糖体二聚化的长型HPF不同，RaiA样蛋白主要稳定失活70S核糖体以利应激解除后快速恢复。尽管该C端结构域因在变形菌中与rpoN共操纵子而历史上被命名为σ⁵⁴调节结构域，但完全缺乏rpoN（σ⁵⁴）基因的Msm仍保留该结构域，反映一种进化外适应，在分枝杆菌中其功能可能独立于σ⁵⁴依赖的转录途径，或作为定位于核糖体平台的机械与调控锚点以在饥饿状态下保障翻译。研究局限在于C端区域实验结构未解析、计算模型置信度较低，其构象与功能意义需实验验证；对接结果为计算预测，不能作为确切结合构象或与HPF竞争性占据的直接实验证据。研究人员将对接位姿与已知实验结构比较，巴龙霉素与新霉素预测定位于h44相关解码中心区域，与实验表征位点一致；氯霉素与四环素预测定位亦与各自实验结构相符。氨基糖苷类结合h44可稳定A位保守核苷酸A1492与A1493（对应Msm中A1476与A1477）的翻出构象，改变解码保真度并促发翻译错误，提示h44局部结构环境的细微改变可能影响氨基糖苷类识别与解码保真度。Δhpf对巴龙霉素与新霉素敏感性降低，而在所选浓度下对氯霉素与四环素敏感性增强，提示HPF效应可能并非均一地作用于所有核糖体靶向抗生素。本研究氨基糖苷类表型与既往报道的分枝杆菌蛋白Y（MPY；MSMEG_1878）在锌饥饿期间介导氨基糖苷类耐受的结果相反，可能反映生理条件与所测氨基糖苷类（既往研究为卡那霉素与链霉素）的差异，且Δhpf生长减慢本身可能影响抗生素活性。研究人员强调需在生长速率匹配条件下进一步研究并直接分析HPF-核糖体互作。结论部分译为：本研究为理解HPF在耻垢分枝杆菌中的作用提供了结构与功能框架。研究结果支持全长HPF蛋白（包括其C端区域）参与核糖体相关功能并在所考察条件下影响对特定抗生素的应答。预测的全长结构为进一步研究未解析的C端区域提供了基础，抗生素应答表型则提示HPF与核糖体相关抗生素敏感性之间可能存在联系。未来需在Δhpf背景下开展基序定向突变与截短回补分析，以明确各基序与结构域对HPF功能的贡献；鉴于HPF在细菌适应与应激恢复中的既定作用，还应采用适当的活力检测方法考察其对多种生理应激应答的贡献。总体而言，这些发现为核糖体相关因子如何影响细菌生理与抗生素应答提供了新见解，同时强调需通过实验研究明确其潜在分子机制。