不同Musa品种活跃内生微生物组功能的宏转录组解析

《Microbiology Spectrum》：Metatranscriptomic profiling of active endophytic microbiome functions across diverse Musa cultivars

　　

植物-内生菌共生关系对植物健康与抗逆性具有重要作用，但内生微生物组的活跃功能相较于土壤和根际微生物组仍缺乏系统表征。研究人员采用宏转录组分析（metatranscriptomic profiling）对在相同环境条件下生长的7个Musa品种的非培养富集内生微生物组（culture-free enriched endophytic microbiomes）进行表征，以鉴定所采样组织中的活跃微生物类群和功能注释。由于每个基因型与组织组合仅有一个宏转录组样本，本初步研究（pilot study）聚焦于各样本中检测到的微生物转录本和功能，而非检验品种或组织间差异。非培养富集产生了跨样本的宏转录组图谱，包括5,434个分类学注释和32,694个来自表达微生物转录本的基因注释。功能注释涵盖次级代谢（secondary metabolism）、能量产生、环境信息处理、转运系统、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、氮代谢、群体感应（quorum sensing）、生物膜形成（biofilm formation）和异源物质生物降解（xenobiotic biodegradation）等通路。包括Bradyrhizobium sp.在内的若干类群在多个样本中被检测到，并与多种功能注释相关联。约30–35%的序列读长被注释为假设蛋白（hypothetical proteins），表明许多检测到的转录本功能仍然未知。相关性分析还揭示了检测到的通路谱之间的样本水平关联。总体而言，该初步宏转录组数据集为香蕉内生菌研究提供了资源，并为未来植物-微生物组互作和微生物-微生物关系研究鉴定了候选微生物类群和功能通路。

研究背景：植物微生物组，尤其是内生菌（endophytes），与植物健康、生长及抵御病害和环境胁迫密切相关。然而，由于内生菌培养困难及在植物体内评估整个群落功能的挑战，内生微生物组相较于土壤和根际微生物组仍缺乏深入了解。尽管已有研究聚焦于单个类群或人工微生物群落（SynCom），但尚未捕获完整的植物体内内生群落功能。香蕉（Musa spp.）因具有广泛的遗传多样性，是研究宿主变异如何影响内生微生物多样性和功能的理想模型。商业香蕉品种因长期驯化和克隆繁殖，可能已丧失微生物组多样性和功能。Singh等（24）利用鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics）研究了野生和栽培香蕉的内生微生物群落组成并预测了潜在功能，但宏基因组学只能预测基因库，无法直接测量活跃群落功能。因此，本研究旨在超越宏基因组学，表征内生宏转录组谱，以深入理解这些群落内的活跃功能。研究人员分析了来自同一地点、相似环境条件下生长的7个遗传背景多样的Musa品种的地上和地下组织的微生物基因表达模式，采用非培养微生物组富集方案减少非目标植物RNA和测序成本。基于先前研究，研究人员预测野生二倍体香蕉内生微生物组将表现出比栽培三倍体更大的分类学和功能多样性。本研究设计为初步宏转录组分析，采样侧重于包括多样品种而非在每个品种内进行生物学重复。

主要技术方法：研究采集了来自佛罗里达州Homestead小农场的7个香蕉基因型（包括2个三倍体AAA品种、2个二倍体BB植物、1个三倍体AAB煮食蕉和2个二倍体种），每个品种采样1株植物，采集地上部（叶和茎）和地下部（根/球茎）组织。采用已发表的非培养富集方案分离微生物细胞，提取总RNA后经rRNA去除和链特异性RNA-seq文库构建，在Illumina HiSeq 2500平台进行150 bp双端测序。生物信息学分析采用SAMSA2流程和MetaPro并加以修改，包括PEAR合并双端读长、Trimmomatic质量过滤、SortMeRNA去除rRNA、rnaSPAdes组装转录组、DIAMOND BLASTx对NCBI NR蛋白数据库进行分类学注释，以及MetaGeneMark预测编码序列和GhostKOALA进行KEGG直系同源（KO）注释。基于读长的分析采用BWA-MEM将读长比对至微生物contigs，并通过DIAMOND和SEED Subsystems进行注释。数据归一化采用DESeq2中位数比值法。

研究结果：

内生微生物组富集成功度与宏转录组组装质量：经PEAR和Trimmomatic处理后剩余389.82 Gbp序列数据，rRNA去除后剩余74.01 Gbp推定mRNA读长。其中约90%归属于细菌，约3%归属于真菌和病毒，1.6%归属于Musa，约6%未分类。

香蕉内生宏转录组中检测到的微生物类群和功能通路：分类学组成分析鉴定了5,434个分类学注释，主要归属于Pseudomonadota、Chlamydiota和Firmicutes。若干类群在样本间持续检测到，包括地上部样本中的Aspergillus fumigatus、Bradyrhizobium brasilense、B. elkanii和Escherichia coli，以及地下部样本中常见的Xanthomonas citri、Methylobacterium radiotolerans和Bacillus safensis。KEGG通路分析鉴定了146条通路，主要功能类别包括微生物在多种环境中的代谢、能量产生、次级代谢产物生物合成、萜类和聚酮化合物生物合成、异源物质生物降解等。KEGG注释中环境信息处理和细胞过程高度代表，包括膜转运、细胞群落相关通路和细胞运动。32,694个基因注释的分析显示地上和地下微生物群落的转录谱存在变异。假设蛋白在两个区室中持续检测到。PCA显示不同品种和组织的单个Musa样本间分类学和功能转录丰度存在变异。

单个Musa植物和组织间微生物组组成与功能的变异：大多数检测到的类群仅在单个Musa样本中发现，仅有10个分类学注释在全部样本中持续检测到。Bradyrhizobium sp.在所有品种和组织中高度代表，其转录本与多种功能通路相关联，包括碳固定、硫代谢、苯甲酸降解、氯代烷烃降解、次级代谢产物生物合成（如吩嗪）、ABC转运蛋白和群体感应等。Spearman相关性分析显示了Bradyrhizobium sp.与其他类群转录谱之间的正负相关模式。

内生微生物组通路与植物相关功能表达的相关性：研究人员聚焦于代谢、定殖、通讯、转运、分泌、环境响应和次级代谢产物生物合成相关的微生物功能，采用Spearman相关性分析基于KEGG level 3注释鉴定功能通路谱之间的关联。结果显示各样本微生物组之间的差异模式。

样本间检测到的微生物类群共享功能：研究人员鉴定了匹配101个不同类群的转录组读长，其转录本与细菌趋化性、群体感应、生物膜形成、ABC转运蛋白、双组分系统、细菌分泌系统和磷酸转移酶系统等功能相关。还鉴定了匹配56个不同类群的转录组读长，其基因注释涉及碳固定、甲烷代谢、氮代谢、氧化磷酸化和硫代谢。在次级代谢产物产生通路方面，鉴定了25个不同类群的转录组读长，其中仅一个类群（Bradyrhizobium sp.）在所有植物的单内酰胺生物合成通路中一致出现。

讨论部分总结：本初步研究聚焦于7个Musa品种的内生微生物组宏转录组，以鉴定其活跃微生物群落和功能。研究发现内生菌转录谱在单个采样植物间存在变异。Bradyrhizobium sp.在多个样本中检测到，其转录本注释到可能参与植物-微生物组互作的多种功能，且与其他活跃类群存在多样的相关性模式，提示Bradyrhizobium可能影响内生群落过程。微生物转录谱在大多数其他内生类群中也显示品种间变异，表明内生群落功能多样性。研究检测到与内生菌活性常见的功能相关的植物体内微生物组转录本，包括趋化性、群体感应、生物膜形成以及ABC转运系统、双组分调控系统、细菌分泌机制和磷酸转移酶系统等环境功能。研究还鉴定了与次级代谢产物通路相关的KO注释转录本，包括单内酰胺、新生霉素、链霉素和萜类骨架生物合成，这些代谢物具有已知的抗微生物特性，所检测到的注释鉴定了可能与植物-微生物互作和植物防御相关的候选微生物功能。Escherichia coli和Aspergillus fumigatus的转录本在多个样本中检测到，但仅凭检测不能确认它们是已建立的香蕉内生菌。研究还鉴定了群体感应、生物膜形成和次级代谢产物产生相关通路之间的转录谱关联。研究结论翻译：总之，本初步宏转录组研究在近期宏基因组学结果（24）的基础上，提供了关于香蕉内生菌分类学和功能转录谱样本水平变异的若干关键见解。研究数据补充了关于内生菌功能的有限但不断增长的文献体系，并突出了可在未来重复研究中检验的内生微生物多样性、功能活性和宿主基因型之间关系的模式。