《Biochemical and Biophysical Research Communications》：A paper-based electrochemical aptasensor functionalized with silver nanoparticles for the detection of African swine fever virus p30 protein
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•非洲猪瘟病毒（ASFV）p30蛋白的纯化及针对ASFV p30蛋白的新型适配体的鉴定•基于银纳米粒子的适配体传感器的制备，用于检测ASFV p30蛋白•所开发适配体传感器的灵敏度、特异性和稳定性的全面评估引言非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的急性、高度传染
• 非洲猪瘟病毒（ASFV）p30蛋白的纯化及针对ASFV p30蛋白的新型适配体的鉴定
• 基于银纳米粒子的适配体传感器的制备，用于检测ASFV p30蛋白
• 所开发适配体传感器的灵敏度、特异性和稳定性的全面评估
引言 非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的急性、高度传染性和致命性的猪疾病。该疾病已对多个国家造成重大经济损失[1]。该疾病于1909年首次在肯尼亚被发现。ASFV在撒哈拉以南非洲地区仍然流行，并已传播到欧洲、亚洲和加勒比地区，给猪肉产业带来了沉重的财务负担[2]。感染猪只会出现高烧、虚弱、呕吐、出血性腹泻以及鼻腔和结膜分泌物增多等症状[3]。该疾病的发病率和死亡率可达到100%[4]、[5]。在过去两年中，为控制疫情，已有超过3000万头家猪被扑杀，这对养猪产业造成了严重打击，并扰乱了全球经济[6]、[7]。到目前为止，尚未有任何针对ASF的疫苗获得商业应用批准[8]。因此，快速准确地检测ASFV对于控制其传播和减少经济损失至关重要。
ASFV是一种大型二十面体DNA病毒，也是唯一主要在感染细胞细胞质中复制的DNA病毒[9]。传播途径包括直接或间接接触，以及通过软蜱传播。该病毒仅感染猪科动物，不同年龄和品种的猪对病毒的易感性各不相同[10]。ASFV的基因组长度约为170至193千碱基对（kbp），包含150-167个开放阅读框（ORFs）。其中一些ORF的功能尚未明确或尚未预测[3]、[11]、[12]。ASFV的p30蛋白由CP204L 基因编码，该基因在感染后2-4小时内开始表达，并在整个病毒复制周期中持续存在[13]。由于p30蛋白在感染早期就出现，因此它是早期诊断的理想靶标，基于p30的检测方法受到了广泛关注[14]。
传统的ASFV检测方法包括红细胞吸附试验、免疫学检测和基于分子生物学的技术[15]、[16]、[17]。分子生物学方法具有高灵敏度，是ASFV检测的金标准，但需要样品预处理和专业设备，且其灵敏度容易导致假阳性[14]、[18]。免疫学检测操作简便，但由于抗体批次间变异性大、制备复杂以及生产周期长等挑战，其应用受到限制[19]、[20]。因此，当前的研究主要集中在开发新型检测方法上，特别是在诊断试剂和技术方面。
适配体作为单克隆抗体的替代品，在目标识别、治疗、诊断和生物工程领域展示了巨大潜力[21]、[22]、[23]。适配体是短链单链DNA或RNA寡核苷酸，能够高亲和力结合特定目标分子[24]、[25]。与传统抗体相比，适配体具有多种优势，如更广泛的靶向特异性、成本效益更高的生产方式、更好的可修饰性和更高的稳定性[22]、[23]、[26]。由于其基于核酸的特性，适配体能够在更广泛的存储和处理条件下保持稳定，并且可以以干粉或冻干形式长期保存。此外，其化学合成方法能够实现可重复的生产，批次间差异小，生产成本可能低于基于抗体的试剂[27]。这些优点使得适配体特别适合开发便携、可靠且成本效益高的诊断平台，适用于现场和资源有限的环境。
适配体是通过一种称为“指数富集系统进化”（SELEX）的体外 选择过程生成的，该过程可以分离出能与多种目标（如小分子、蛋白质、纳米颗粒和活细胞）结合的序列[24]、[28]、[29]。目前，适配体在食品安全和生物医学领域得到广泛应用，主要用于诊断中的识别探针和靶向药物输送载体[30]、[31]、[32]。适配体在检测病毒蛋白方面也表现出优异的稳定性和多功能性，同时也可作为治疗剂使用。虽然适配体最初是为识别病毒表面糖蛋白（如HSV-1和流感病毒中的糖蛋白）设计的，但已有研究成功开发出能识别其他病毒蛋白的适配体，包括HIV tat蛋白和Zika病毒基质蛋白[33]、[34]、[35]、[36]。
生物传感器是将生物信号转换为可量化电信号的分析装置[37]。近年来，由于适配体具有出色的生物相容性、特异性和灵敏度，它们在生物传感器开发中受到重视[38]。基于适配体的生物传感器（称为适配体传感器）已被有效用于检测多种病毒病原体，如登革热病毒、诺如病毒、MERS-CoV、新城疫病毒、西尼罗河病毒和裂谷热病毒，从而证明了其在诊断应用中的多功能性[25]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]。此外，银纳米粒子因其独特的物理化学性质（如表面等离子体共振、可调节的大小和形态以及简单的表面修饰能力）而在生物传感器平台中受到广泛关注，这些特性增强了信号转导和整体传感器性能[44]。
在本研究中，表达了重组ASFV p30蛋白并将其纯化。随后筛选出针对该蛋白的适配体。经过测序和表征后，成功鉴定出一种特异性针对ASFV p30蛋白的适配体。将这种适配体与ASFV p30蛋白及电化学生物传感器平台结合，开发出了新型电化学适配体传感器，用于检测ASFV p30蛋白。这项工作为建立快速、灵敏的ASFV检测方法奠定了技术基础。
章节片段 ASFV p30蛋白的克隆、表达和纯化 ASFV的p30蛋白基因（GenBank接入号
NC_001659.2 ）经过密码子优化后进行了合成（GenScript，美国）。用于ASFV p30蛋白克隆和表达的
大肠杆菌 DH5α和BL21（DE3）菌株购自Novagen公司（美国）。通过PCR扩增的p30蛋白基因被克隆到原核表达载体pET-28a（Thermo Fisher，美国）中。通过限制性内切酶（
Bam HI和
Xho I） digestion及测序确认了p30基因的成功插入。
重组ASFV p30蛋白的纯化和表征 重组ASFV p30蛋白带有6X-His标签，分子量约为30 kDa，主要存在于可溶部分。在0.5 mM IPTG培养条件下实现最佳表达，诱导后4小时达到蛋白表达峰值。通过SDS-PAGE分离出的高蛋白浓度样品经过透析处理，重组p30蛋白的纯度通过SDS-PAGE和Western blot验证（图1A）。蛋白浓度为
讨论 非洲猪瘟是一种对全球养猪产业造成巨大经济影响的毁灭性疾病[4]、[47]。因此，快速准确的诊断对于尽早发现、干预和持续监测ASF疫情至关重要[48]。传统的ASF检测方法包括在猪巨噬细胞中分离病毒、聚合酶链反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹和间接免疫染色[49]。尽管
结论与未来展望 本研究表明，所开发的基于适配体的传感器在检测ASFV p30蛋白方面表现出优异的分析性能。选定的适配体对目标蛋白具有很强的特异性，这一点通过分子对接和等温滴定量热法得到证实。这些结果表明，本研究开发的适配体可能成为传统抗体的有效替代品。值得注意的是，该适配体传感器实现了1.09 ng/mL的低检测限，并具有高
CRediT作者贡献声明 Saumitra Singh： 方法学设计、概念化。Nilave Ranjan Bora： 初稿撰写、验证、方法学研究、数据分析、概念化。Sachin Kumar： 撰写与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念化。Jagriti Narang： 监督、概念化
利益冲突声明 ? 作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的研究工作。
致谢 作者衷心感谢Sushil Kumar在实验程序方面提供的宝贵帮助。我们实验室的ASFV研究目前得到了印度生物技术部 （项目编号BT /PR41246/NER /95/1685/2020）的支持。
Nilave Ranjan Bora|Saumitra Singh|Jagriti Narang|Sachin Kumar
