治疗性噬菌体在临床获批晶体液输注中的稳定性

《Microbiology Spectrum》：Stability of therapeutic bacteriophages in clinically approved crystalloid infusion solutions

　　

抗菌药物耐药性负担日益加重，凸显了对传统抗生素有效替代方案的需求，噬菌体治疗代表了一种有前景的方法。然而，储存和给药过程中产品稳定性不足可能降低实际递送剂量并干扰临床疗效评估。临床获批的晶体液输注溶液可促进噬菌体的制备与给药，但其用于噬菌体储存的适用性仍表征不足。本研究评估了四种裂解性噬菌体（靶向铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus））在0.45%氯化钠、0.9%氯化钠、乳酸林格液、醋酸林格液及盐水镁（SM）缓冲液中的稳定性。含10?空斑形成单位每毫升的噬菌体制剂在4°C、?20°C或?80°C条件下储存，添加或不添加10%甘油，最长储存6个月。噬菌体感染力高度依赖于噬菌体种类、溶液类型及储存温度。缓冲溶液通常比盐水更能保持感染力，尤其在冷冻条件下。甘油可改善冷冻期间的稳定性，但其效果幅度因噬菌体而异，且在盐溶液中最为明显。?80°C加甘油储存为所有四种噬菌体提供了最一致的保存效果，效价保持接近基线水平。林格液在?80°C下即使不加甘油也支持高稳定性。相比之下，4°C储存导致较大变异性和多种噬菌体稳定性降低。这些发现表明，临床获批的晶体液可作为噬菌体储存和给药的载体，并提示需要进行噬菌体特异性稳定性检测。

抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance）和难治性细菌感染的日益严峻形势重新激发了研究人员对噬菌体治疗的兴趣——即利用感染并裂解细菌的病毒进行医学治疗。尽管动物研究和同情用药病例系列报告了令人鼓舞的结果，但随机对照试验（randomized controlled trials）尚未证实其疗效。噬菌体制剂的药物学表征不足可能是一个促成因素。已有报道显示给药产品中噬菌体效价降低，保质期稳定性不足被认为是PhagoBurn等试验失败的一个促成因素。由于噬菌体是生物活性颗粒，其感染力依赖于病毒粒子完整性、胶体稳定性以及蛋白质结构和功能的保持。储存和给药过程中稳定性不足可降低递送至患者的感染性噬菌体剂量，干扰临床疗效评估，并限制研究间的可比性。

噬菌体稳定性受温度、pH、离子组成、渗透压和缓冲条件的强烈影响。盐镁（SM）缓冲液等实验室缓冲液可保持感染力，但并非为临床给药而设计或批准。现有大多数研究考察的是实验室配方、非医疗应用或冻干等技术要求较高的方法。唯一一项评估临床输注溶液的研究仅限于等渗配方，未研究冷冻储存，且排除了长尾噬菌体（siphoviruses）。因此，适用于静脉给药的临床已确立晶体液中的稳定性仍表征不足。

随着治疗性噬菌体进入正式的药品和监管框架，这一差距日益重要。欧洲药典已引入噬菌体治疗药品章节，欧洲药品管理局已发布涉及生产、质量控制和稳定性的指南草案。欧洲各国监管机构也日益要求良好生产规范（Good Manufacturing Practice, GMP）。符合GMP要求、可直接使用的适用于静脉给药的噬菌体制剂可促进跨给药途径的临床使用。

本研究评估了四种不同形态类型的裂解性噬菌体在四种常用临床获批晶体液输注溶液及SM缓冲液（作为实验室标准）中不同储存条件下的稳定性。目的是确定临床已确立的晶体液是否能提供简单、廉价且实用的液体制剂，以保持噬菌体感染力并符合良好生产规范。

研究人员开展了以下研究：选用四种裂解性噬菌体，分别靶向铜绿假单胞菌（ΦPB1和ΦDMS3vir）和金黄色葡萄球菌（ΦK和Φ44AHJD），涵盖三种主要形态类型。ΦPB1和ΦK分别代表PB1样（Pbunavirus）和K样（Kayvirus）噬菌体，是广泛研究和有前景的治疗组。ΦDMS3vir和Φ44AHJD分别作为长尾噬菌体和短尾噬菌体（podovirus）代表。噬菌体在固体培养基上使用各自宿主菌进行扩增，经氯化铯（CsCl）梯度超速离心纯化，随后超滤换液至相应储存溶液中。制剂调整为1×10? PFU/mL，在4°C、?20°C或?80°C条件下储存，添加或不添加10%甘油，最长6个月。噬菌体效价采用双层法测定。统计分析采用高斯混合效应模型，测量值低于检测限者按左删失处理，基于每噬菌体5,000个参数自举数据集进行推断。

研究结果如下：

噬菌体表现出不同的稳定性特征。稳定性在噬菌体、配方和储存温度之间差异显著。6个月效价范围从9.8 log10 PFU/mL（表明高稳定性）至检测限2.5 log10 PFU/mL。噬菌体表现出不同的稳定性特征（P < 0.001）。ΦK最不稳定，6个月效价为9.2 log10 PFU/mL至不可检测水平。Φ44AHJD和ΦPB1表现出中等稳定性（分别为4.0–8.4 log10 PFU/mL和4.9–8.6 log10 PFU/mL）。ΦDMS3vir总体最稳定，6个月效价为4.7至9.8 log10 PFU/mL，在林格液中各温度下始终保持在≥8.6 log10 PFU/mL。SM缓冲液作为实验室参考，在4°C（7.7至9.7 log10 PFU/mL）和?80°C（7.5至9.5 log10 PFU/mL）下对所有噬菌体均保持高稳定性。

缓冲溶液改善了噬菌体稳定性。在所测试的噬菌体中，缓冲晶体液（乳酸林格液和醋酸林格液）通常比非缓冲盐水溶液（NaCl 0.45%和NaCl 0.9%）更好地保持噬菌体效价，平均Δ1.4 log10 PFU/mL（95% CI, 1.2–1.5, P < 0.001）。该效应在ΦK中最为显著，其在缓冲溶液中4°C和?80°C下效价保持较高（8.1–8.6 log10 PFU/mL），但在盐溶液中大幅降低（4°C下Δ3.5–4.3 log10 PFU/mL，?80°C下Δ > 6.1 log10 PFU/mL）。对于Φ44AHJD，缓冲配方也改善了稳定性，但程度较小（4°C下Δ1.2–1.8 log10 PFU/mL，?20°C下Δ0.8–2.1 log10 PFU/mL，?80°C下Δ1.7–2.4 log10 PFU/mL）。对于ΦPB1，林格液配方在?80°C下优于盐水（Δ1.5–2.0 log10 PFU/mL）。同样，ΦDMS3vir在冷冻条件下缓冲溶液中表现出改善的稳定性（?20°C下Δ2.1–3.7 log10 PFU/mL，?80°C下Δ3.7–4.9 log10 PFU/mL）。总体而言，林格液配方在?80°C下保持高效价，6个月效价在乳酸林格液中为8.0至9.6 log10 PFU/mL，在醋酸林格液中为8.2至8.9 log10 PFU/mL。

甘油增加了冷冻储存期间的稳定性。添加10%甘油显著改善了所测试溶液中冷冻条件下的噬菌体稳定性（平均效应Δ1.4 log10 PFU/mL [95% CI, 1.4–1.5], P < 0.001）。在各噬菌体中，甘油在?80°C盐溶液中表现出最强的冷冻保护效应：添加甘油时效价为7.8至9.8 log10 PFU/mL，而未添加时为2.5–6.7 log10 PFU/mL。对于ΦK，甘油在?20°C下未改善任何临床溶液中的稳定性，但在?80°C下显著增加了NaCl溶液中的稳定性（Δ5.9–6.0 log10 PFU/mL）。对于Φ44AHJD，甘油补充的效果更为异质：添加至NaCl中使效价增加Δ2.0 log10 PFU/mL，但在?20°C下NaCl 0.45%中除外（Δ?0.2 log10 PFU/mL）。在SM缓冲液中，?20°C下添加甘油与较低效价相关（Δ?1.2 log10 PFU/mL）。对于ΦPB1，甘油在?20°C下适度改善稳定性（增加0.7–1.1 log10 PFU/mL），在?80°C下NaCl溶液中增加Δ1.7–2.3 log10 PFU/mL。同样，甘油在冷冻盐配方中对ΦDMS3vir效果最大（Δ3.3–5.0 log10 PFU/mL），而在林格液中无论是否补充甘油均保持高稳定性。

?80°C加甘油实现最高稳定性。在所有测试条件中，?80°C加10%甘油储存对每种噬菌体在各溶液中产生最一致的稳定性，并随时间保持最接近基线的效价（平均效应Δ2.3 log10 PFU/mL [95% CI, 2.3–2.4], P < 0.001）。对于ΦK，6个月效价为8.4–9.2 log10 PFU/mL。相应范围对于Φ44AHJD为7.8–8.4 log10 PFU/mL，对于ΦPB1为8.3–8.7 log10 PFU/mL，对于ΦDMS3vir为9.5–9.8 log10 PFU/mL。

讨论部分总结：本研究评估了四种噬菌体在四种常用临床晶体液输注溶液中冷藏和冷冻条件下6个月的稳定性。研究结果表明，常用晶体液输注溶液不仅可作为给药载体，还可作为噬菌体的储存介质。这对于临床实施尤为重要，因为即用型液体制剂可简化物流并避免冻干等复杂且昂贵的工艺。缓冲溶液的优越性能强调了物理化学条件在维持噬菌体完整性方面的重要性。衣壳结构可能决定了对离子强度和渗透压应激、pH变化及冻融损伤的易感性。盐水溶液缺乏缓冲能力，可能使噬菌体暴露于pH波动，导致结构损伤和感染力丧失。先前研究表明这些因素可影响噬菌体聚集并可逆性降低感染力。相比之下，乳酸林格液和醋酸林格液等平衡晶体液提供了更稳定的环境，可能更好地保持衣壳结构。噬菌体间观察到的显著变异性强调了稳定性是内在的且具有噬菌体特异性。即使靶向同一细菌种类的密切相关噬菌体也表现出不同的稳定性特征。这一发现对治疗开发具有直接意义，表明稳定性检测应针对每个候选噬菌体单独进行，而非从相关病毒外推。因此，稳定性应被视为治疗候选物选择的关键标准。这种变异性对噬菌体鸡尾酒尤为重要，其中组分间的相互作用可能进一步影响稳定性。先前的临床经验表明，组装的噬菌体混合物可能随时间失去数个数量级的效价，可能损害疗效。从临床角度看，配方选择必须在噬菌体稳定性与安全性和相容性之间取得平衡。虽然SM缓冲液或磷酸盐缓冲盐水（PBS）等实验室缓冲液提供高稳定性，但它们既未获临床批准也未在此背景下进行评估。非离子赋形剂可能改善保质期，但其临床适用性仍不确定，因为胶体制剂在复苏环境中与不良结局相关。同样，某些常见输注溶液如葡萄糖基液体在静脉给药大容量后可能产生不良生理效应如低钠血症。平衡晶体液在临床实践中常规使用，在稳定性、安全性和相容性之间提供了实用折衷。使用甘油作为冷冻保护剂可进一步增强冷冻储存期间的稳定性，尽管增加了渗透压，但其临床适用性应仔细考虑，特别是关于张力和剂量方面。在此背景下，?80°C下乳酸林格液中不加甘油储存可能代表一种简单且临床相容的选择，尽管这需要针对个别噬菌体进行确认。应考虑到若干局限性。稳定性在受控实验室条件下评估，可能受临床环境中其他因素影响，包括容器材料、操作程序和温度波动。仅评估了四种噬菌体，观察到的它们之间的显著变异性限制了对其他治疗性噬菌体候选物的外推，强调了个体稳定性检测的必要性。未来研究应阐明噬菌体不稳定的机制，以便从噬菌体和配方特征预测稳定性。在开发噬菌体鸡尾酒时，应评估每种单独噬菌体、噬菌体组合和完整鸡尾酒的稳定性，以确定噬菌体-噬菌体相互作用或反复冻融循环是否可能影响稳定性。研究结论翻译：噬菌体稳定性似乎高度依赖于配方和储存条件，且噬菌体间差异显著。缓冲溶液，特别是乳酸林格液和醋酸盐，与非缓冲盐水相比提供了优越的稳定性，而渗透条件似乎在决定噬菌体稳定性方面作用较小。?80°C储存提供了最可靠的感染力保存。这些发现支持使用临床获批晶体液作为噬菌体治疗的便捷载体，并强调在治疗性噬菌体产品开发中进行噬菌体特异性稳定性检测的必要性。