植物介导金纳米颗粒作为可持续光热纳米治疗剂用于黑色素瘤治疗

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Plant-mediated gold nanoparticles as sustainable photothermal nanotherapeutics for melanoma treatment

　　

黑色素瘤（Melanoma）是一种侵袭性皮肤癌，常对常规疗法表现出耐药性，凸显了替代治疗策略的必要性。本研究利用Dicoma anomala（D. anomala）叶甲醇提取物作为天然还原剂、封端剂和稳定剂，用于金纳米颗粒（AuNPs）的绿色合成。使用该药用植物提取物为传统化学合成方法提供了一种生态友好的替代方案，因为其生物活性植物化学物质可协助纳米颗粒形成，同时减少对苛刻化学试剂的需求。提取物中存在的植物来源化合物可能有助于金离子的还原和所形成纳米颗粒的稳定。随后对合成的AuNPs进行表征，以确认其成功形成、稳定性、形貌、表面性质及进一步生物医学评估的适用性。这些表征技术验证了AuNPs的成功合成，并提供了其结构特征、表面性质、形貌和胶体稳定性的证据。在525 nm激光、10 J/cm²能量密度照射后，AuNPs表现出中等光热活性，伴随细胞内活性氧（ROS）显著升高约3.5倍，触发黑色素瘤细胞线粒体介导的凋亡。使用A375人黑色素瘤细胞进行的体外评估，包括MTT实验、ROS检测和活/死荧光成像，显示出明显的剂量依赖性细胞毒性反应。来自caspase-3、-8和-9荧光分析以及基于ELISA的细胞色素c定量的进一步机制研究，证实了通过线粒体途径激活凋亡。总体而言，这些发现表明D. anomala介导的AuNPs代表了一种可持续、有效且靶向的光热剂，用于黑色素瘤治疗，具有克服现有治疗局限性的潜力。

癌症仍是全球最严重的疾病之一，其发病率近几十年来持续上升。黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的侵袭性癌症，仅占皮肤癌病例的2%，却导致80%的皮肤癌相关死亡，是最致命的皮肤癌类型。尽管近年来黑色素瘤治疗取得进展，但仍需要更精确靶向癌细胞、提高疗效并减少副作用的疗法。光热治疗（PTT）作为一种微创纳米医学策略应运而生，利用光吸收剂将光转化为局部热疗以实现靶向肿瘤消融。在各类光热剂中，金纳米颗粒（AuNPs）因其独特的表面等离激元共振（SPR）、生物相容性和易于表面功能化而备受关注。随着对AuNPs生物医学兴趣的增加，对安全、高效、可靠合成方法的需求日益增长。绿色合成提供了一种可持续、生物相容的替代方案，避免了传统化学方法的毒性和环境风险。D. anomala是一种非洲药用植物，富含多酚类成分，具有多种药理活性，为AuNP合成提供了有前景的生物资源。本研究旨在探究利用D. anomala叶提取物绿色合成的AuNPs对A375黑色素瘤细胞的PTT潜力，选择525 nm激光波长以匹配球形AuNPs的SPR峰（约550 nm），从而在不需要近红外激发的条件下实现浅表黑色素瘤病变的有效治疗，并在10 J/cm²激光剂量下评估AuNP介导PTT的疗效和安全性。

研究人员开展了以下研究：从赞比亚东部高地采集D. anomala叶片（由ZARI鉴定，编号0006064），经干燥、粉碎后用甲醇在Soxhlet装置中提取。通过将10 mL 0.1 g/L HAuCl₄溶液与1 mL提取物混合，80 °C搅拌过夜合成AuNPs，颜色变为紫/红色表明纳米颗粒形成。纯化后的AuNPs经UV-Vis光谱（300–800 nm）、FT-IR（500–4000 cm^?1）、动态光散射（DLS）、zeta电位、SEM/EDS和HR-TEM进行表征。A375人黑色素瘤细胞（ATCC）在含10% FBS、1%两性霉素B和1%青霉素-链霉素的DMEM中培养，以5–25 μg/mL AuNPs处理，525 nm二极管激光（10 J/cm²）照射，通过倒置光显微镜观察形态，LIVE/DEAD?试剂盒进行定性活力评估，MTT法测定定量活力和IC50。在IC50浓度（19.19 μg/mL）下用红外热成像相机监测光热响应，DCFH-DA探针检测细胞内ROS。采用荧光多重活性试剂盒测定caspase-3、-8、-9活性，ELISA试剂盒定量细胞色素c释放。使用SPSS（版本27）进行单因素方差分析，OriginLab Pro 2018作图。

研究结果显示：UV-Vis分析显示合成AuNPs在550 nm处有明显SPR峰，而植物提取物在340 nm处有吸收峰，确认了AuNPs的成功合成。FTIR分析显示3434、2920、1637、1384和603 cm^?1处的峰，表明羟基、亚砜、羰基、羧酸盐和醚等功能团参与纳米颗粒稳定，证实D. anomala植物化学物质作为天然还原剂和封端剂的作用。SEM显示明确的纳米颗粒形貌，EDX确认金为主要元素；HR-TEM显示主要为球形颗粒，部分为棒状、菱形和不规则形状，平均尺寸77.1 ± 9.5 nm；DLS显示平均水合粒径96.34 ± 7.5 nm，PDI为0.134，表明相对单分散；zeta电位为?28.6 mV，表明中等胶体稳定性。MTT实验显示AuNPs在PTT下对A375细胞产生剂量依赖性细胞毒性，IC50为19.19 μg/mL，单独激光无效果，≥10 μg/mL时毒性显著（p < 0.01）；形态学评估显示IC50 AuNPs加激光处理组细胞出现剂量依赖性皱缩、脱落和不规则形状；活/死染色显示对照组和单独激光组无细胞死亡，而IC50 AuNPs处理组红色（死亡）细胞显著增加。红外热成像显示525 nm激光照射下温度从21.5 °C升至29.8 °C（ΔT ≈ 8.3 °C），虽然整体温度处于亚消融水平，但局部细胞内热应激结合ROS约3.5倍升高足以激活下游凋亡通路。caspase活性分析显示caspase-3在各处理组逐渐升高，caspase-8在處理组显著升高，caspase-9升高最为显著（尤其在AuNPs IC50加激光组），表明主要通过内源性（线粒体）凋亡途径并辅以外源性途径。ELISA显示AuNPs IC50加激光组细胞色素c释放最高，与AuNPs IC50单独处理相比显著增加（p < 0.001），表明激光照射增强了AuNP介导的光热/光动力活性，导致线粒体损伤和凋亡增加。

讨论部分总结：PTT是一种成熟的选择性癌症治疗方法，AuNPs因其生物相容性、小尺寸、易于表面修饰和强光热转换效率而广泛用于PTT。本研究证实D. anomala介导的AuNPs具有靶向、有效且环境可持续的纳米医学潜力。UV-Vis、FTIR、SEM、EDX、HR-TEM、DLS和zeta电位等表征手段共同验证了绿色AuNPs的成功合成及其适用于生物医学应用的理论化特征。MTT实验显示剂量依赖性细胞毒性，与先前报道的AuNP介导PTT增强细胞毒性作用一致。形态学变化（细胞缩小、染色质浓缩、核碎裂、膜起泡、细胞间黏附丧失）与先前研究一致。ROS在PTT中起重要作用，热应激破坏线粒体功能和细胞氧化还原平衡，导致ROS产生增加和氧化损伤。研究证实IC50 AuNPs经激光激活后作为有效光热剂具有强大潜力。为确保观察到的生物效应归因于绿色合成AuNPs的光热活性而非残留粗植物成分，纳米颗粒在合成过程中经过彻底洗涤去除游离的未结合D. anomala提取物；暗毒性评估显示IC50浓度下细胞毒性极小，而激光激活诱导显著细胞毒性和ROS升高约3.5倍，这一鲜明对比证实主要治疗机制是光触发光热转换和纳米偶联物的ROS生成，而非植物封端剂本身的固有毒性。然而，由于缺乏仅提取物对照，不能排除残留植物来源植物化学物质的贡献，需要进一步研究确认AuNPs在观察效应中的作用。caspase-3、-8、-9荧光分析与先前研究一致。细胞色素c ELISA显示升高的CytC水平表明D. anomala介导的AuNPs诱导A375黑色素瘤细胞线粒体介导的凋亡性细胞死亡。与先前主要关注AuNPs固有细胞毒性的研究不同，本研究进一步探究了其在共振激光激发（525 nm，10 J/cm²）下的光热效力。激光照射后增强的治疗反应表明光热诱导的细胞应激可能增强凋亡信号传导。此外，使用D. anomala提取物提供了一种环境友好且可持续的纳米颗粒合成方法。总之，这些发现表明D. anomala介导的AuNPs作为生物相容且高效的光热剂用于黑色素瘤治疗具有相当大的潜力，但仍需进一步的临床前和临床研究评估其长期安全性、生物分布、治疗性能和临床转化潜力。

研究结论翻译：本研究成功展示了利用D. anomala叶提取物绿色合成AuNPs并评估了其对A375黑色素瘤细胞的光热治疗潜力。合成的AuNPs表现出良好的理化特征，并在525 nm激光照射后有效降低黑色素瘤细胞活力。机制研究揭示了增强的线粒体功能障碍和凋亡，表现为细胞色素c释放增加，突出了内源性凋亡途径的参与。这些发现提供了新证据，表明D. anomala介导的AuNPs可在共振激发条件下作为有效光热剂，从而增强抗癌疗效。从实践角度来看，环境友好的合成方法结合AuNPs的光热特性，为开发可持续且生物相容的纳米药物治疗黑色素瘤提供了有前景的策略。这些纳米颗粒将光转化为局部热量的能力可能有助于更靶向和微创的治疗干预。未来需要进行体内研究以进一步评估其安全性、生物分布、治疗疗效和临床转化潜力。研究局限性在于缺乏仅植物提取物对照，无法区分植物来源成分与合成AuNPs的贡献，因此观察到的效应不能完全归因于纳米颗粒，需要进一步对照实验确认其光热反应的特异性贡献。