《Biochemistry and Biophysics Reports》：Transcriptomic benchmarking positions iPSC-Derived intestinal organoids as immature, non-malignant epithelial references for colorectal cancer tissue
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原发结直肠癌（colorectal cancer, CRC）活检组织与肠道类器官常被相互比较，以界定肿瘤相关的上皮改变；然而，这两类系统在恶性状态、组织构成、发育阶段及上皮成熟度上均存在差异。本研究对CRC活检组织、配对的正常肠道组织及iPSC来源肠道类器官（
原发结直肠癌（colorectal cancer, CRC）活检组织与肠道类器官常被相互比较，以界定肿瘤相关的上皮改变；然而，这两类系统在恶性状态、组织构成、发育阶段及上皮成熟度上均存在差异。本研究对CRC活检组织、配对的正常肠道组织及iPSC来源肠道类器官（iPSC-derived intestinal organoids, iIOs）进行转录组分析，以界定区分原发组织与类器官上皮状态的生物学轴。全转录组分析显示，CRC活检组织与iIOs之间存在显著分离，且iIOs偏离原发组织的程度远大于肿瘤偏离正常黏膜的程度。通路富集与细胞解卷积分析显示，活检组织以反映组织复杂性的免疫、炎症及基质程序为主，而iIOs则富集增殖、生物合成及代谢程序。将样本投射至恶性轴上，iIOs处于中性位置，表明其偏离源于发育状态而非恶性转化。与正常黏膜相比，类器官可重复性地丧失成体组织相关的免疫/基质程序，同时获得增殖性、胎儿样上皮程序。肠道细胞图谱（Gut Cell Atlas）评分、隐窝-表面定位及谱系解卷积显示，iIOs保留肠道上皮身份，但处于以短暂扩增（transit-amplifying）程序为主、分化谱系多样性有限的发育不成熟、隐窝/祖细胞偏向状态。代谢模块分析及合成代谢-增殖相关性分析显示，iIOs代谢活性升高，包括生物合成与核苷酸合成程序。上述特征反映的是增殖偶联的合成代谢，而非恶性样代谢重编程；糖酵解-氧化磷酸化（OXPHOS）平衡在各组间无显著差异。因此，iIOs是代谢活跃的、胎儿样、隐窝/祖细胞性上皮参考模型，而非成体肠道黏膜或原发CRC组织的直接转录组替代物。上述结果阐明了iIOs作为结直肠癌研究上皮参考模型的效用与局限。
研究背景方面，结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球高发病率与高死亡率的主要恶性肿瘤之一，其发生涉及增殖失控、组织结构破坏、细胞分化程序丧失、代谢重编程、表观遗传失衡及肿瘤微环境重塑等多层次生物学转变。正常肠道上皮沿隐窝-绒毛轴形成高度有序的极性结构，由干细胞、短暂扩增细胞（transit-amplifying cells）及分化的肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞与肠内分泌细胞协同构成；而在结直肠肿瘤中，这一层级结构被显著破坏。原发肿瘤活检组织不仅包含肿瘤上皮，还包含成纤维细胞、免疫细胞、血管成分及细胞外基质等间质成分，因此其转录组同时反映肿瘤细胞内在信号与强烈的微环境贡献。现有研究通常将原发结直肠肿瘤活检与肠道类器官的关系简化为有限的若干癌症相关标志物或特定功能读数，但两类系统之间的差异超越单个基因或孤立通路，需要在转录组、组织免疫/基质含量、上皮组织与谱系构成、发育身份及代谢状态等多个层面共同考察。iPSC来源肠道类器官（iPSC-derived intestinal organoids, iIOs）由重编程体细胞产生，来源非恶性，不同于直接来源于肿瘤组织并保留其恶性与基因组特征的患者来源肿瘤类器官。因此，明确iIOs究竟是肿瘤组织的健康样上皮对应物、一种发育性上皮状态，还是仅捕捉肠道上皮身份部分方面的培养相关参考，具有重要必要性。
基于此，研究人员生成并表征了iIOs，并对原发CRC活检组织、配对正常肠道组织及iIOs进行比较转录组分析，采用差异表达分析、基因集富集分析、 curated signature评分、leading-edge基因分析、细胞群解卷积、基于Gut Cell Atlas的上皮基准分析及代谢模块分析，界定区分原发组织与类器官状态的生物学轴。研究假设原发CRC活检与iIOs占据不同的转录组状态：前者保留免疫、基质及组织层面微环境程序，后者代表发育不成熟、隐窝/祖细胞偏向的上皮参考状态；并检验iIOs的代谢状态反映的是恶性相关重编程还是增殖偶联的合成代谢。研究结论表明，iIOs保留肠道上皮身份并形成有序三维结构，但相较原发组织呈现不成熟、高增殖及胎儿样特征；其与原发组织的分离并非源于肿瘤活检的恶性性质，而是源于iIOs作为更纯净、胎儿样上皮肠道模型的属性。iIOs在恶性轴上呈中性定位，不表现恶性特征，其增殖状态反映隐窝/祖细胞、胎儿样身份而非恶性来源；其代谢升高与增殖高度相关，符合支持生物量积累的增殖驱动合成代谢，而非自主的恶性样代谢重编程。因此，iIOs不能替代成体正常黏膜或作为原发CRC活检的对应物，而应定位为互补的、发育上界定的正常上皮参考模型，其价值在于模拟肠道上皮发育、基准化分化方案及提供患者配对的非恶性基线，用于受控扰动实验；患者来源肿瘤类器官仍是CRC建模的首选，因其保留来源肿瘤的组织学、基因组特征与药物反应行为。
研究方法方面，研究纳入6例组织学确诊结直肠腺癌患者，每例贡献一份原发肿瘤活检、一份取自同一切除标本非肿瘤切缘的配对正常黏膜活检，以及一份由其外周血单个iPSC克隆生成的iIO；所有iIO在相同分化方案下生成，于第120天（第20代）单批次测序。关键技术方法包括：采用无整合仙台病毒（Sendai virus）重编程策略由外周血来源红系祖细胞生成iPSCs，并经多能性及三系分化潜能验证；采用三步定向分化方案生成结肠类器官；以流式细胞术检测CXCR4/CD117界定定型内胚层分化效率；以免疫荧光与RT-qPCR验证多能性、肠道谱系标志及胎儿/祖细胞身份；对活检组织与iIO分别行批量RNA测序（bulk RNA-seq），经FastQC、Cutadapt、STAR两遍比对至GRCh38并行基因水平计数；采用患者配对设计的PyDESeq2进行差异表达分析；并行无监督分析（PCA、相关性、层次聚类）与基于MSigDB Hallmark的前 ranked GSEA；采用curated signature评分、MCP-counter免疫/基质构成估计、基于Gut Cell Atlas胎儿/成体上皮特征及上皮谱系的单样本GSEA与非负最小二乘（NNLS）解卷积、隐窝-表面分区分析、代谢模块分析、Warburg指数、CMS分类及恶性轴分析；统计以双侧患者配对t检验为主，并以Wilcoxon符号秩检验复核，多重检验采用Benjamini-Hochberg校正。
研究结果方面，第一，iPSC来源肠道类器官的生成与表征：通过流式细胞术显示定型内胚层标志CXCR4高阳性、CD117显著表达而PDGFRα低表达，免疫荧光显示CDX2自第3天至第9天表达升高，三维培养形成球状/类器官样上皮结构，已建立类器官表达Chromogranin A、KLF5、FOXA2、Villin、Lysozyme、LGR5及CDX2等肠道上皮、祖细胞与分化谱系标志，证实成功生成保留肠道上皮身份的iIOs。第二，iIOs偏离原发结直肠组织的程度大于肿瘤与配对正常黏膜之间的差异：PCA显示活检与iIO样本沿PC1清晰分离，PC1解释63.0%总变异，活检样本离散度更大而iIO样本聚集更紧密；配对差异表达显示肿瘤对正常比较得732个差异表达基因，而类器官对肿瘤及类器官对正常比较分别得10476与8692个基因；GSEA将这种分离归因于iIOs的增殖程序（MYC、E2F、G2M）与组织的免疫炎症信号。第三，活检组织以免疫-基质程序为主而iIOs富集增殖与生物合成程序：Hallmark GSEA显示活检强烈富集免疫与炎症程序，iIOs富集生物合成、代谢、增殖及蛋白稳态程序，KEGG与Reactome分析呈一致方向；程序水平汇总显示活检以免疫/炎症激活及宿主防御/补体程序为主，iIOs以增殖/生物合成驱动、代谢组织及蛋白稳态/分泌程序为主；leading-edge基因热图显示活检协调富集免疫、炎症、抗原呈递、白细胞相关及补体基因，iIOs高表达增殖、代谢组织及蛋白稳态基因；signature评分显示iIOs在吸收性肠上皮细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞、Notch相关、脂质合成、OXPHOS及TCA循环等特征上得分较高，活检在基质/成纤维细胞及免疫浸润特征上较高；MCP-counter与NNLS解卷积证实活检免疫与基质含量显著高于iIOs，故活检的免疫炎症富集不应解释为肿瘤内在上皮程序。第四，iIOs未能重获成体黏膜程序而保留胎儿样上皮状态：正常黏膜对类器官比较高度一致（log2FC Pearson r=0.74），得1705个在正常黏膜中持续更高及1251个在类器官中持续更高的基因；类器官中丢失的基因富集免疫、炎症与基质程序，类器官中获得的基因富集MYC靶基因、E2F靶基因、MTORC1信号、G2M检查点、未折叠蛋白反应及胆固醇稳态，且该获得程序强烈富集胎儿上皮基因（Fisher OR=9.8，p=2×10?21，如AFP、NAP1L1、NPM1、HMGA1）；Gut Cell Atlas胎儿/成体上皮特征评分将iIOs置于对角线（胎儿≈成体），而正常与肿瘤组织位于其下（成体>胎儿），发育指数（胎儿?成体）在iIOs（≈0.00）显著高于正常（?0.32）或肿瘤（?0.37）组织；qRT-PCR显示相对亲本iPSCs，iIOs的AFP、CDX2与LGR5分别高表达121、98与386倍，验证胎儿肠道上皮身份获得与隐窝/祖细胞程序激活。第五，iIOs在隐窝-表面轴上占据隐窝基底/增殖位置：隐窝-表面分区指数将各组排序为正常黏膜（+0.79）>肿瘤（+0.05）>iIO（?0.84），正常组织与类器官差异显著（p=0.013）；热图显示iIOs协调表达MKI67、PCNA、TOP2A、BIRC5、CCNB1、CDK1、FOXM1及MCM2等隐窝基底与增殖相关基因，而表面分化标志在iIOs中富集较不一致；iIOs保留结构与上皮相关组织特征，活检显示较高基质重塑活性。第六，iIOs偏向短暂扩增/祖细胞谱系而耗竭分化细胞类型：signature评分显示iIOs保留吸收性肠上皮细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞及Notch相关等多个肠道谱系相关程序，活检干细胞（LGR5）、杯状/分泌及肠道身份转录因子相关得分较高；ssGSEA显示iIOs富集循环短暂扩增细胞（对正常p=0.010），耗竭成熟结肠细胞（p=0.008）、BEST4+细胞（p=0.001）与tuft细胞（p=0.027），肠内分泌细胞相对过多（p=0.023）；基于Gut Cell Atlas参考的绝对上皮谱系解卷积独立证实iIOs显著的短暂扩增/祖细胞偏向，表明iIOs保留肠道上皮谱系身份但处于祖细胞偏向、分化谱系多样性有限的状态。第七，iIOs代谢升高反映增殖偶联的合成代谢：相较活检，iIOs在脂质合成（BH-FDR<0.05）、糖酵解、TCA循环及氧化磷酸化上广泛升高，模块水平显示生物合成程序与糖酵解、OXPHOS协调上调，脂肪酸氧化为例外；糖酵解减OXPHOS指数在各组均低且无统计学差异，不呈Warburg型转变；复合合成代谢评分与增殖评分在所有样本中强相关（Pearson r=0.89，p=8.9×10?7），模块水平以核苷酸合成（r=0.96）、磷酸戊糖途径（r=0.92）、谷氨酰胺分解（r=0.83）、胆固醇/甲羟戊酸（r=0.80）及糖酵解（r=0.79）偶联最强，分解性脂肪酸氧化模块呈负相关（r=?0.46）；上述模式在转录水平符合增殖驱动的支持生物量产生的合成代谢，而非恶性样代谢转换，但需同位素示踪、耗氧或细胞外通量等功能性代谢测定确认。
讨论部分总结：研究在转录组框架内比较了患者来源iIOs与其CRC活检及配对健康肠道活检，发现iIOs具有肠道上皮组织但相较原发组织呈不成熟、高增殖及胎儿样特征；其主导转录谱反映发育成熟阶段而非恶性转化。iIOs与肿瘤及正常组织活检之间变化的基因数超过肿瘤与配对正常组织之间变化基因数的10倍以上，说明分离的原因并非肿瘤活检的恶性性质，而是iIOs代表更纯净的胎儿样上皮肠道模型；活检中免疫、基质与炎症的转录优势反映组织层面微环境复杂性而非肿瘤内在上皮编程。iIOs未获得成体组织构型而呈发育性胎儿样上皮组织，文献报道PSC来源肠道模型类似胎儿肠道并可通过移植或共培养等促进成熟，且其成熟状态依赖方案并在研究间异质；本文结果表征的是一种广泛使用方案、单时间点（第120天）评估的iIOs，其胎儿/祖细胞偏向程度在成熟优化条件下可能不同。谱系分析显示iIOs准确重建隐窝增殖祖细胞区室为主要群体，但尚未恢复终末分化与特化谱系；需注意所用为批量RNA-seq，解卷积为基于Gut Cell Atlas及已发表数据集的估计性观察。恶性轴分析显示肿瘤评分为正、正常黏膜为负（BH校正p=0.024），iIOs呈中性（恶性指数≈0）且与恶性极（p=0.027）及正常黏膜极（p=0.026）均显著不同，结合队列外特征评分显示iIOs在增殖与隐窝/祖细胞相关程序（E2F、G2M、MYC靶基因、WNT/β-catenin）上高于正常黏膜，但不在肿瘤特异性致癌驱动因子上，KRAS-up评分低于正常黏膜而p53无变化；但恶性轴源自同队列肿瘤对正常差异，存在内在循环性，iIOs的中性定位应作为多项汇聚证据之一，恶性潜能的确定评估依赖iPSC系基因组表征。代谢分析显示iIOs总体代谢特征升高但Warburg指数无组间差异，合成代谢与增殖相关性在iIOs最高，模块水平以核苷酸合成、磷酸戊糖途径、谷氨酰胺分解及胆固醇生物合成偶联最强而脂肪酸氧化呈负相关，符合扩张培养中支持生物量积累的增殖相关合成代谢而非自主恶性样代谢重编程；该解释完全基于RNA水平特征评分，需正交功能测定确认。研究强调iIOs是有价值的上皮参考系统，保留肠道身份、形成有序三维结构并支持上皮分化与发育模式的受控研究，但不能替代成体正常黏膜或作为原发CRC活检的对应物，也不能视为恶性癌症模型；本研究首次使用同一患者来源样本证明iIOs沿发育而非致癌轴偏离原发组织。在结直肠癌建模中，患者来源活检肿瘤类器官仍是首选，因其保留来源肿瘤组织学、基因组特征与药物反应行为；iIOs应定位为互补的、发育上界定的正常上皮参考，与患者来源肿瘤类器官、成体正常类器官及组织切片模型相区分，其独特价值在于作为同基因、非恶性、发育上界定的系统，用于模拟肠道上皮发育、基准化分化方案并提供患者配对非恶性基线。研究局限包括：队列较小（6例患者配对样本），亚组比较与CMS分类为描述性；基于批量RNA-seq，解卷积与signature评分为推断性，需单细胞或空间验证；解卷积参考仅为上皮，活检比例反映上皮转录信号构成而非绝对细胞类型比例；结论为转录组层面，需功能、蛋白质组及代谢测定确认；类器官采用单一分化方案与单时间点（第120天）；恶性轴基于单队列衍生轴，个别致癌特征差异未通过多重检验校正，非恶性解释依赖多项分析汇聚。
研究结论翻译：iIOs是代谢活跃的、胎儿样、隐窝/祖细胞性上皮参考模型，而非成体肠道黏膜或原发CRC组织的直接转录组替代物；上述结果阐明了iIOs作为结直肠癌研究上皮参考模型的效用与局限。
