脑深部电刺激通过扩增CLIC3+自然杀伤细胞亚群经TGFB1介导的免疫—神经元交互抑制帕金森病神经炎症的多组学解析

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Multi-omics profiling suggests deep brain stimulation-associated expansion of CLIC3+ NK cells attenuates neuroinflammation in Parkinson's disease

　　

脑深部电刺激（DBS）可缓解帕金森病（PD）症状，但其免疫调节机制尚未阐明。通过整合微阵列数据（GSE23676）、单细胞/单核RNA测序数据（GSE184950、GSE202210、GSE223138、GSE243639；经质量控制（线粒体基因含量<25%、基因数>200）后纳入616,076个高质量细胞）及全基因组关联研究（GWAS）数据，研究人员鉴定出CLIC3为与DBS相关且对PD具有潜在保护意义的因子。CLIC3在一个独特的自然杀伤细胞亚群（NK_CLIC3）中选择性上调，该亚群分泌TGFB1以抑制神经炎症。CellChat与免疫组织化学揭示，NK_CLIC3细胞通过THY1–ADGRE5与GZMA–PARD3轴与PD相关神经元群体——兴奋性（SLC18A2⁺）、抑制性（SLC18A2⁺）、少突胶质细胞（SLC18A2⁺）及星形胶质细胞（SLC18A2⁺）——进行通讯。免疫浸润分析（GSE114517；n=75）提示PD脑内NK细胞浸润及M2型巨噬细胞募集不足，凸显抗炎反应不充分。研究人员进一步通过荧光激活细胞分选（FACS）从一名健康供者中分离CLIC3阳性NK细胞，并证实其降解α-突触核蛋白（PD病理蛋白）的能力，支持NK(CLIC3⁺)细胞在PD中的潜在保护功能。研究结果提示，DBS可能通过扩增NK_CLIC3细胞，经TGFB1介导的免疫—神经元交互抑制神经炎症，将CLIC3定位为PD的潜在治疗靶点。

帕金森病（PD）是全球第二大常见的神经退行性疾病，以黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失及α-突触核蛋白聚集体蓄积为特征。尽管对症治疗取得进展，疾病修饰疗法仍难以实现。脑深部电刺激（DBS）手术是治疗PD最先进的神经外科方法之一，是晚期PD患者的重要治疗手段。工程学与影像学的进步以及对脑部疾病认识的深化，有望重塑DBS的认知与实施方式。基于局部场电位记录预测最佳刺激触点具有可行性，可提高PD中DBS程控效率。然而，DBS的生物学基础，尤其是其对神经炎症和免疫细胞动力学的影响，仍知之甚少。越来越多的证据表明免疫失调是PD发病机制的关键驱动因素。全基因组关联研究（GWAS）已将PD与参与免疫反应的基因联系起来，HLA-DRB5的遗传变异与PD相关。此外，单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析揭示PD中脑内驻留及外周免疫细胞群体发生深刻改变，包括促炎性小胶质细胞扩增和T细胞功能障碍。值得注意的是，传统上以抗肿瘤和抗病毒功能著称的自然杀伤（NK）细胞，近期被发现可通过调节神经炎症发挥神经保护作用。近期研究已将CLIC3鉴定为精神分裂症的核心免疫相关枢纽基因。此外，精神分裂症大鼠模型血浆及特定脑区中CLIC3表达显著降低，而利培酮治疗可逆转这一改变，提示CLIC3可能作为潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。研究人员对接受DBS治疗的PD患者的初步微阵列数据分析显示，外周血中CLIC3显著上调，促使研究人员探究其功能相关性。随后，研究人员发现CLIC3主要表达于NK细胞。据此，研究人员提出假说：DBS与CLIC3⁺NK细胞扩增相关，后者继而通过旁分泌信号和细胞间相互作用减轻神经炎症。为验证此假说，研究人员整合了包括DBS相关转录组、PD GWAS以及脑组织与外周血scRNA-seq/snRNA-seq在内的多组学数据集。该分析揭示了一个以CLIC3为标志的NK细胞亚群（NK_CLIC3），并提示NK_CLIC3在DBS相关效应中的潜在作用。细胞通讯图谱进一步揭示，NK_CLIC3通过配体—受体对THY1–ADGRE5和GZMA–PARD3与PD相关神经元亚型（即SLC18A2⁺兴奋性神经元、抑制性神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞）发生相互作用。这些发现为DBS相关神经保护提供了机制性见解，并提示CLIC3⁺NK细胞可能是PD的可干预治疗靶点。

研究人员开展了以下研究：首先，对来自公共基因表达综合数据库（GEO）的微阵列基因表达谱数据进行差异基因表达分析，比较DBS治疗前后PD患者及正常对照，筛选差异表达基因（DEGs），标准为校正P值<0.05且|log2倍数变化|>1。其次，整合来自81个样本（涵盖脑组织与外周血）的scRNA/snRNA-seq数据进行综合分析，经质量控制（排除线粒体reads>25%或检测基因<200的细胞）后保留616,076个细胞，使用harmony包去除批次效应，利用Seurat、stringr、SCP等包进行预处理、降维聚类及基因表达可视化，FindAllMarkers函数鉴定各细胞亚群代表性基因，clusterProfiler包进行基因本体（GO）富集分析（采用Fisher精确检验的单侧版本，P值经Benjamini-Hochberg法校正）。第三，以CLIC3的表达数量性状基因座（eQTL）数据（ID: eqtl-a-ENSG00000169583；n=31,684；18,471个SNPs）为遗传工具，针对三个独立GWAS数据集（ieu-a-812，n=5,691；finn-b-PD_DEMENTIA，n=216,895；finn-b-PD_DEMENTIA_EXMORE，n=111,888）所代表的PD结局进行两样本孟德尔随机化（MR）分析，使用TwoSampleMR包，采用逆方差加权（IVW）、加权中位数、加权众数、MR-Egger回归及简单模式法估计因果效应。第四，使用Monocle3包对抑制性神经元和星形胶质细胞进行拟时序轨迹推断。第五，使用CellChat包进行细胞—细胞通讯分析，计算细胞簇间通讯概率并通过filterCommunication（min.cells=10）去除低丰度细胞群的噪声信号。第六，利用人类蛋白质图谱数据库的免疫组织化学（IHC）数据分析THY1、PARD3和SLC18A2在脑组织中的表达水平。第七，使用CIBERSORT R包对GSE114517数据集（包含75份脑组织样本的批量RNA测序数据）进行免疫细胞浸润比例估计。第八，从一名健康志愿者采集外周血样本（经川北医学院伦理委员会批准），通过Ficoll密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMCs），与标记抗体孵育后经流式细胞术分选，先收集CD56⁺CD3^?NK细胞，再从NK细胞组分中进一步分离CLIC3阳性细胞群以获得目标NK-CLIC3细胞。第九，取10⁶个细胞用RIPA裂解液裂解提取蛋白，经BCA法定量后行蛋白质印迹（WB）分析，所用一抗为β-actin（42 KDa，1:100,000稀释）和α-syn（15–19 KDa，1:1000稀释）。

研究结果如下：

1. CLIC3在DBS治疗后外周血中上调，可能代表PD中的潜在保护因子。研究人员对DBS治疗前后PD患者及正常对照的微阵列基因表达谱数据进行差异基因分析，结果显示CLIC3在PDS3组中较其他三组（HC、PDS1、PDS2）分别增加两倍以上。随后以CLIC3为暴露因素、PD为结局进行孟德尔随机化分析，提示CLIC3可能赋予PD潜在保护效应的关联。五种分析方法对各结局的β值均小于0，表明CLIC3与PD呈负相关，提示CLIC3为保护因素；其中以finn-b-PD_DEMENTIA为结局的加权中位数法P值为0.02，以finn-b-PD_DEMENTIA_EXMORE为结局的加权中位数法P值为0.03，均具有统计学显著性。为探究CLIC3在PD患者中的具体细胞和生物学机制，研究人员获取了81个样本的整合单细胞/单核测序数据进行进一步研究。样本包括外周血和脑组织数据，所有细胞聚类为9个不同细胞亚群：小胶质细胞（C3、LRMDA、DOCK8）、少突胶质细胞（MBP、PLP1、ST18）、T/NK细胞（CD3D、NKG7、GNLY）、兴奋性神经元（CAMK2A、CBLN2、LDB2）、内皮细胞（CLDN5、ABCB1、EBF1）、抑制性神经元（GAD1、LHFPL3、PCDH15）、星形胶质细胞（AQP4、ADGRV1、GPC5、RYR3）、髓系细胞（CD68、S100A8、S100A9）和B细胞（MS4A1、CD79A、CD19）。CLIC3表达模式分析显示CLIC3主要表达于T/NK细胞亚群。CLIC3在T/NK细胞亚群中的平均表达水平为1.29（HC）和1.38（PD）；其他细胞亚群平均水平均小于0.1，第二高的B细胞亚群为0.07（HC）和0.08（PD）。这些结果提示CLIC3主要表达于T/NK细胞亚群，且在PD患者中略有升高。整合多组学分析表明，DBS治疗相关的外周血CLIC3上调可能发挥与PD相关的正向调节作用。此外，这种上调可能增强T/NK细胞的数量或活性，从而进一步促进与PD管理相关的效应。

2. 单细胞整合分析提示CLIC3主要表达于NK细胞，并鉴定出具有增强免疫激活能力的NK_CLIC3亚群。对T细胞和NK细胞进行亚聚类后，分为7个细胞亚群：T_Na?ve、T_Regulatory、T_Memory、T_Effector、NK_CLIC3、NK_KLRC1和NK_KLRC2。PD患者中NK细胞在T/NK细胞群体中的总体比例低于正常对照样本。其中，NK_CLIC3亚群高表达NKG7、GNLY、FGFBP2和CLIC3。此外，CLIC3在正常对照和PD患者中均有表达。其中，NK_CLIC3细胞亚群中CLIC3水平在所有细胞亚群中最高，平均表达水平为4.74（HC）和5.66（PD）；其他NK细胞亚群表达水平均低于3.5，T细胞亚群表达水平均低于1，提示CLIC3主要表达于NK细胞，并在NK_CLIC3亚群中表达最高。三个NK细胞亚群的富集分析提示，与其他两个NK细胞亚群相比，NK_CLIC3亚型中细胞因子通路及免疫相关通路（如T/B细胞受体信号通路和参与免疫反应的细胞激活）的激活最强。通过亚群细化，研究人员发现CLIC3主要集中于NK_CLIC3亚群，该亚群表现出更强的细胞因子和免疫反应通路激活。该结果提示NK_CLIC3亚群可能在PD患者的DBS效应中具有潜在作用。

3. 通过亚聚类分析鉴定PD相关兴奋性神经元亚群。研究人员提取兴奋性神经元群体进行亚聚类分析，共鉴定出12个不同细胞亚群。其中，兴奋性神经元（F3⁺）比例在PD患者组中较高，而兴奋性神经元（SLC18A2⁺）亚群比例在PD患者中低于对照。基于PD相关基因（PARK7、LRRK2等）对细胞亚群进行评分，发现两个兴奋性神经元亚群——兴奋性神经元（SLC18A2⁺）和兴奋性神经元（HTR2C⁺）——与PD尤为密切相关。对PD患者与健康对照（HC）之间兴奋性神经元（SLC18A2⁺）的差异基因分析显示，GFAP和ZEB2等基因在PD中高表达。GFAP在健康对照中的平均表达水平为1.43，在PD患者中为5.81；ZEB2在健康对照中的平均表达为3.18，在PD患者中为3.86。值得注意的是，SLC18A2在SLC18A2⁺亚群中的平均表达水平为6.22，显著高于其他亚群（均不高于1.5）。进一步富集分析提示，与HC样本相比，PD患者来源的兴奋性神经元（SLC18A2⁺）中涉及泛素结合、树突棘功能和神经元迁移的通路显著激活。总之，研究人员鉴定了一个与PD相关的兴奋性神经元（SLC18A2⁺）亚群，该亚群可能参与可能与PD发病机制相关的免疫相关过程。树突棘相关通路的异常可能与突触丢失和神经网络功能障碍相关。此外，巨自噬和自噬调节的显著改变提示细胞清除病理蛋白聚集体能力下降。

4. PD抑制性神经元亚群概述。对抑制性神经元进行亚聚类后，定义了10个相关细胞亚群。基于PD相关基因鉴定PD相关细胞亚群，发现抑制性神经元（SLC18A2⁺）亚群与PD相关。SLC18A2在该亚群中的平均表达水平为1.90，而其他所有亚群的平均表达不高于0.2。抑制性神经元亚群的拟时序轨迹分析显示，抑制性神经元（SLC18A2⁺）属于细胞发育早期阶段。细胞亚型比例分析提示，抑制性神经元（EYA4⁺）和抑制性神经元（HPSE2⁺）亚群比例在PD患者中高于正常对照样本。相反，抑制性神经元（SLC18A2⁺）亚群比例在PD患者中低于正常样本。与HC相比，PD来源的抑制性神经元（SLC18A2⁺）细胞表现出显著增强的髓鞘化/髓鞘和β-连环蛋白相关过程，同时伴有突触组织的显著缺陷。总之，该研究鉴定了与PD相关的特定抑制性神经元亚群，其比例和发育阶段存在差异。这些见解有助于更细致地理解PD的细胞景观，并可能支持未来针对这些特定亚群的治疗策略探索。

5. 少突胶质细胞（GAD1⁺）和少突胶质细胞（SLC18A2⁺）被鉴定为与PD密切相关。少突胶质细胞被亚聚类为13个不同细胞亚群。其中，与PD关联最强的亚群被鉴定为少突胶质细胞（GAD1⁺）和少突胶质细胞（SLC18A2⁺）。PD相关标志基因显示，PINK1、VPS35和UCHL1在这两个少突胶质细胞亚群中显著高表达。少突胶质细胞（GAD1⁺）亚群的差异富集分析提示，PD中的GAD1⁺少突胶质细胞表现出以树突形态发生、黏附连接、JUN激酶结合、GTP酶调节活性和核苷三磷酸酶调节活性为中心的独特功能特征，可能与突触丢失和环路功能障碍相关。PD中的SLC18A2⁺少突胶质细胞显示出以树突棘、miRNA结合和β-连环蛋白结合为主导的功能程序，提示这些细胞参与突触和轴突变性通路。此外，这两个PD相关少突胶质细胞亚群的数量在PD患者中显著低于正常样本，提示PD患者中相关功能可能存在损伤或丢失。

6. SLC18A2⁺星形胶质细胞是一个以发育和髓鞘为焦点、在PD中耗竭的亚群。对所有星形胶质细胞进行亚聚类，鉴定出10个不同细胞亚群。关键PD相关基因（PARK7、LRRK2等）的表达水平在不同星形胶质细胞亚群中显示出不同模式。高表达PD相关基因的星形胶质细胞亚群为星形胶质细胞（SLC18A2⁺）。该亚群的富集分析提示PD患者与健康对照之间存在显著功能差异。在PD患者中，髓鞘化、细胞—细胞接触区、髓鞘、β-连环蛋白结合和髓鞘结构成分显著上调。与先前报道一致，PD相关星形胶质细胞亚群SLC18A2⁺在PD患者中减少。拟时序分析进一步提示SLC18A2⁺星形胶质细胞处于活性升高的中间发育状态。关键基因APBB1IP、ARHGAP15、DOCK8和ELMO1在发育早中期高表达，而ADGRV1表达在后期达到峰值。这些发现共同提示星形胶质细胞（SLC18A2⁺）亚群与PD相关，其生物学功能和基因表达模式与正常状态相比发生改变。

7. 以NK_CLIC3为中心的免疫—神经元交互及PD区域免疫浸润。研究人员从PD样本中提取NK_CLIC3细胞及所有PD相关细胞（包括兴奋性神经元（SLC18A2⁺）、抑制性神经元（SLC18A2⁺）、少突胶质细胞（SLC18A2⁺）和星形胶质细胞（SLC18A2⁺））进行进一步分析。为探究PD脑组织中的免疫细胞浸润景观，研究人员检查了细胞因子表达及相关信号通路。首先，在这些细胞类型之间鉴定出多种细胞相互作用，其中NK_CLIC3与兴奋性神经元（SLC18A2⁺）之间的相互作用强度最强。具体而言，NK_CLIC3细胞与兴奋性神经元表现出广泛交互，共涉及18条信号通路，而少突胶质细胞交互最少，仅约7条通路。此外，NK_CLIC3细胞表达IFN-γ、TNF-α和TGF-β，其中TGF-β上调。研究人员进一步鉴定出少突胶质细胞（SLC18A2⁺）通过THY1–ADGRE5配体—受体轴与NK_CLIC3细胞结合，而GZMA–PARD3通路可能介导NK_CLIC3依赖性的PARD3表达抑制。免疫组织化学（IHC）验证了THY1、PARD3和SLC18A2在人脑样本中的表达。扩展的免疫浸润分析揭示脑组织中可能存在CD4⁺T细胞、NK细胞和M2型巨噬细胞浸润。在PD中，M2型巨噬细胞浸润在杏仁核和黑质中减少，而内侧颞回相对于对照未观察到差异。NK_CLIC3细胞协调THY1/ADGRE5-GZMA/PARD3免疫—神经元轴和TGF-β分泌，这可能代表一种抑制神经炎症的有前景的治疗策略。

8. CLIC3阳性细胞亚群能够降解α-syn。研究人员通过流式细胞术从一名健康供者的外周血中分离NK细胞。CD3阳性比例为3.13%，表明有效去除T细胞；CD56阳性比例为99.7%，确认NK细胞身份；CLIC3阳性比例为53.28%。纯化的CLIC3⁺NK细胞随后被收集并培养用于进一步实验。为评估NK细胞是否内化细胞外α-syn，研究人员将CLIC3⁺NK细胞暴露于α-syn聚集体，并通过蛋白质印迹分析不可溶性α-syn种类的内化。NK细胞中未观察到可检测的内源性α-syn。体外实验显示，来自健康供者的CLIC3⁺NK细胞在体外内化并降解α-syn。为监测细胞内α-syn的降解，研究人员将CLIC3⁺NK细胞与细胞外α-syn种类孵育1小时，洗涤三次后继续培养不同时间。内化的α-syn种类在孵育后1小时开始降解，4小时时减少，24小时时几乎检测不到。这些发现表明健康供者来源的CLIC3⁺NK细胞可在体外清除α-syn蛋白。

讨论部分总结：PD是全球第二大常见神经退行性疾病，病理机制复杂且缺乏治愈性疗法。DBS是晚期PD患者的重要治疗选择，但其疗效的生物学基础尤其是免疫调节效应长期未完全阐明。通过整合多组学分析，本研究提供证据提示DBS可能通过免疫—神经元交互抑制神经炎症，该过程可能由CLIC3⁺NK细胞扩增驱动，为理解DBS疗效机制提供了新视角。循环淋巴细胞在PD中逐渐下降并可预测未来运动症状进展，DBS作为对症治疗似乎可抵消这种进行性淋巴细胞丢失。DBS驱动从促进神经变性的促炎性CD4⁺T辅助17细胞向抗炎性CD4⁺调节性T细胞转变，从而减轻神经炎症。这些发现提示DBS可调节中枢和外周免疫系统组分，通过免疫抑制/抗炎机制导致临床改善。本研究中，研究人员鉴定出DBS显著上调CLIC3表达。PD患者表现出M2型巨噬细胞浸润减少，导致抗炎能力受损。DBS相关的NK_CLIC3升高可能通过增强抗炎功能来补偿这一缺陷，从而减轻PD患者神经炎症并可能带来治疗获益。既往研究已证明NK细胞有助于抑制PD进展。扩展这些发现，本研究数据进一步提示DBS的治疗效应可能部分由CLIC3⁺NK细胞依赖性清除α-突触核蛋白介导。脑细胞转录组分析强烈支持脑内驻留NK细胞的存在，将NK细胞鉴定为脑实质内一个小而独特且具有生物学意义的细胞簇。NK细胞可能参与清除α-突触核蛋白聚集体——路易体的主要成分，促进PD神经元变性。近期一项研究证明了NK细胞在PD中的神经保护作用，显示NK细胞在体外减少α-突触核蛋白负荷，而在PD临床前小鼠模型中系统性耗竭NK细胞导致多个脑区（包括纹状体、黑质致密部（SNpc）和脑干）病理性α-突触核蛋白蓄积增加。多项研究涉及PD中干扰素-γ（IFN-γ）水平，近期证据显示PD患者血浆IFN-γ水平升高。NK细胞是IFN-γ的主要产生者。在中枢神经系统（CNS）中，IFN-γ改善实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）等自身免疫疾病症状，提示潜在神经保护效应。随着衰老相关NK细胞IFN-γ产生减少，可能对抗原呈递细胞（APCs）在中枢和外周管理病原体（α-突触核蛋白聚集体）的能力产生不利影响。囊泡单胺转运体2（VMAT2）由SLC18A2编码，对将单胺类神经递质包装入突触囊泡至关重要；其失调与精神分裂症、心境障碍和PD相关。近期，SLC18A2（VMAT2）被鉴定为PD中炎症相关差异表达基因的关键枢纽基因。此外，SLC18A2与婴儿型帕金森病-肌张力障碍2相关，代表一种新基因型。本研究中，PD相关细胞亚群表现出高SLC18A2表达。PD中的功能失衡特征为所有分析的神经亚群中髓鞘化、髓鞘组织、β-连环蛋白信号和泛素-蛋白连接酶介导的自噬应激一致上调，同时伴有突触囊泡循环、树突棘维持和突触后特化的显著丢失。突触传递功能障碍常先于早期PD中多巴胺能神经元的大量丢失。Par3–Par6–aPKC复合物在维持突触前/突触后极性、AMPA/NMDA受体转运和突触可塑性中发挥核心作用。PARD3的异常表达或定位可导致突触结构和功能紊乱，可能构成PD早期认知和运动环路损伤的基础。淋巴细胞中的GZMA可通过与PARD3直接相互作用下调PARD3表达。研究人员发现NK_CLIC3细胞通过GZMA–PARD3轴下调SLC18A2⁺神经元亚群中的PARD3，而这些相同神经元通过THY1(CD90)–ADGRE5(CD97)配体—受体对与NK_CLIC3结合。尽管CD90–CD97轴已被证明在胶质母细胞瘤中驱动MAPK/ERK-糖酵解程序，在骨髓增殖性肿瘤中驱动JAK2–STAT5介导的干细胞存活，但其对PD的精确功能贡献仍有待阐明。本研究存在若干局限性。重要的是，评估CLIC3⁺NK细胞降解α-突触核蛋白的体外实验仅使用一名健康供者的血液，而非从PD患者分离的NK细胞。因此，这些结果不能直接证明患者来源的CLIC3⁺NK细胞在疾病相关病理条件下发挥相同的α-突触核蛋白清除效应。PD相关炎症微环境可能重塑NK细胞功能。需要进一步使用从多名PD患者纯化的CLIC3⁺NK细胞进行研究以验证该功能，关于CLIC3⁺NK细胞清除α-突触核蛋白的结论应谨慎解读。此外，CLIC3调节NK细胞功能的具体分子机制以及THY1-ADGRE5和GZMA-PARD3通路的体外验证仍不完整，需要使用细胞共培养和基因敲除实验进一步研究。最后，DBS参数（如刺激频率、强度）与NK_CLIC3扩增之间的剂量—效应关系仍不清楚，需要精细分析。

研究结论部分翻译：总之，研究结果提示CLIC3⁺NK细胞可能具有清除α-syn的潜力，但需要在PD患者来源的细胞和疾病相关模型中验证。DBS是否促进患者来源的CLIC3⁺NK细胞中的这一功能仍有待确定。未来研究可能集中于NK_CLIC3的体外扩增技术和CLIC3靶向药物的开发，推动PD治疗从对症干预向疾病修饰疗法迈进。