生物正交功能化的仿生纳米反应器通过触发一种自我放大的内质网-线粒体应激循环来抑制肺癌干细胞样细胞

《Biomaterials》：Bio-orthogonally Functionalized Biomimetic Nanoreactors Suppress Lung Cancer Stem-like Cells by Triggering a Self-Amplifying Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Stress Loop

　　

摘要

内质网（ER）和线粒体之间的补偿信号传递维持了肺癌干细胞（LCSCs）的存活。本研究设计了一种生物正交功能化的仿生纳米反应器，以破坏这种保护性的相互作用并诱导自放大的应激反馈循环。通过将靶向N-钙粘素的适配体与肿瘤膜掩蔽技术结合，该纳米反应器提高了对LCSCs的特异性。纳米反应器装载了光敏剂TAPP和硼替佐米（BTZ）。在激光照射下，TAPP在局部产生活性氧（ROS），迅速破坏线粒体膜电位并引发氧化损伤。同时，BTZ抑制蛋白酶体，阻止泛素化蛋白的降解并触发急性ER应激，从而促进Ca²⁺进入线粒体，进一步加剧线粒体损伤。反过来，受损的线粒体会释放线粒体DNA（mtDNA），加重ER功能障碍，在ER和线粒体之间建立一个自放大的恶性循环，逐渐加剧细胞损伤。此外，治疗还伴随着STAT3磷酸化的减少和干细胞相关标志物表达的下降，以及ER-线粒体功能障碍的增强和干细胞样细胞的细胞毒性增加。

引言

恶性肿瘤仍然是全球发病率和死亡率的主要原因之一，其特点是不受控制的增殖、治疗抵抗性和高复发率^[1]。越来越多的证据表明，这些特征不仅仅由肿瘤主体群驱动，而且是由一种高度可塑的亚群——癌症干细胞（CSCs）维持的^[2],[3]. CSCs具有自我更新能力、多线系分化潜力以及适应不同微环境的能力。在分子水平上，关键信号通路（如STAT3信号通路）的持续激活赋予CSCs更强的生存能力、免疫逃避能力和对传统疗法的抵抗力^[4],[5]. 这些特性使CSCs成为肿瘤发展、转移和复发的主要驱动因素，使其成为重要的治疗靶点。

在从正常体细胞进化为高度恶性CSC的过程中，细胞的结构和功能架构经历了深刻的重塑^[6]. 这一转化过程伴随着细胞表面拓扑结构的显著变化，包括广泛的膜重塑、表面受体的重新分布以及膜突起的形成。这些形态适应性共同增强了环境感知和细胞间通信^[7],[8]. 功能上，CSCs获得了更高的代谢灵活性、强大的凋亡抵抗力和增强的DNA修复能力。此外，CSCs获得了形成肿瘤球的能力，并在塑造肿瘤微环境（TME）中发挥特殊作用，从而建立一个支持恶性发展的生态位，并促进治疗抵抗性^[9],[10].

CSCs的表型和功能可塑性由一个高度动态的细胞器相互作用和信号级联网络紧密调控。其中，内质网（ER）和线粒体之间的相互作用已成为调节细胞稳态和应激适应性的核心轴心^[11],[12]. 作为细胞内信号转导和免疫调节的关键枢纽，当ER-线粒体相互作用网络受到干扰时，会在不良微环境条件下严重影响CSC的存活。同时，许多动态的细胞内过程持续进行，包括分子信标的快速更新、关键信号级联（如cGAS-STING轴）的激活、囊泡介导的内吞和外排、蛋白质转运以及钙的动员^[13],[14]. 这些过程动态调节并共同维持细胞内信号网络的稳态。在CSCs中，这些动态过程经常被重新编程，以在代谢和治疗压力下维持生存能力，赋予药物抗性，并推动恶性细胞的持续增殖^[15]. 值得注意的是，Ca²⁺作为连接ER应激和线粒体功能障碍的关键调节器；来自ER储存的过量Ca²⁺释放会导致线粒体膜电位变化，引发活性氧（ROS）的产生，并最终导致细胞死亡^[16]. 因此，细胞器间通信和信号网络的复杂相互作用为利用CSC特异性脆弱性提供了机制基础。

受到这些发现的启发，我们假设增强ER-线粒体轴内的应激信号可能是靶向抑制肺癌干细胞样细胞的有效策略。在这项研究中，我们设计了一种光激活仿生纳米反应器TB@CM-Apt，旨在提高对肺癌干细胞样细胞的递送效率并触发细胞器间的协同应激反应。选择介孔氧化锌（ZnO）纳米颗粒作为核心载体，因为它们具有高表面积、良好的生物相容性和pH响应性降解性^[17]. 纳米反应器装载了光敏剂TAPP和蛋白酶体抑制剂硼替佐米（BTZ），这些物质被选用来诱导ER蛋白稳态失衡和线粒体氧化应激^[18],[19]. 为了提高系统稳定性和同源肿瘤靶向性，ZnO核心被包裹在一片来自A549肺癌细胞的天然膜中。这种仿生外壳通过代谢糖工程进一步功能化，使用Ac₄GalNAz引入了叠氮基团，通过生物正交点击化学实现了DBCO修饰的NS13适配体的位点特异性连接。NS13适配体可选择性地识别N-钙粘素，这是一种与转移潜力和干细胞特性相关的上皮-间质转化（EMT）标志物，从而促进向表达N-钙粘素的干细胞样细胞的递送^[20],[21]

TB@CM-Apt的细胞膜减少了免疫清除，NS13适配体使物质主要积聚在N-钙粘素高表达的CSCs中。进入细胞后，内溶酶体的低pH值导致ZnO支架溶解，释放BTZ和TAPP到细胞质中。TAPP在局部产生单线态氧，迅速破坏线粒体膜电位并在激光照射下引发氧化损伤。BTZ抑制蛋白酶体，阻止泛素化蛋白的降解并触发急性ER应激，从而促进Ca²⁺进入线粒体，进一步加剧线粒体损伤。反过来，受损的线粒体会释放mtDNA，加重ER功能障碍，在ER和线粒体之间建立一个自放大的恶性循环，逐渐加剧细胞损伤^[22]. 此外，BTZ抑制p-STAT3，从而损害细胞对细胞器损伤的反应，维持持续受损的状态，并最终放大CSCs的死亡^[23]. BTZ引起的蛋白毒性作用和TAPP诱导的氧化损伤共同破坏了两种细胞器的稳态，促进干细胞样细胞的损伤和死亡^[24]. 这种结合生物正交材料工程、靶向化疗和光动力疗法的方法，为靶向干细胞样细胞及其相关表型提供了明确的技术基础，并支持肺癌个性化纳米医学的发展^[25]

部分摘录

CSCs中ER和线粒体相互作用网络的失衡

肺癌腺癌（LUAD）的临床顽固性很大程度上归因于CSCs的持续存在，它们会策划治疗后的复发和转移。为了识别这一难以捉摸的细胞群中的可操作脆弱性，我们使用单细胞RNA测序系统研究了TME，以探索潜在的干预途径（图1a）。通过系谱特异性标志物验证的系统性细胞类型注释，区分了不同的

讨论

本研究开发了一种光激活仿生纳米反应器TB@CM-Apt，用于靶向肺癌干细胞样细胞并诱导ER-线粒体应激相关的细胞毒性。通过整合来自A549细胞的膜、生物正交点击化学和靶向N-钙粘素的NS13适配体，该平台结合了仿生识别和活性配体介导的靶向^[32],[33]. 介孔ZnO核心还提供了一个pH响应性的药物释放系统，以实现协调

材料

介孔四(4-氨基苯基)卟啉（TAPP）由J&K Scientific Co., Ltd.（上海，中国）提供。硼替佐米（BTZ）从MedChem Express购买。MTT和二甲基亚砜（DMSO）来自Sigma-Aldrich。DBCO-PEG2000-NHS由西安瑞西生物科技有限公司（西安，中国）提供。Hoechst 33342、Calcein-AM/PI双染色试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒、5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑酰碳氰化物（JC-1）试剂盒，

CRediT作者贡献声明

熊艳： 形式分析。穆思琪： 编写 – 原稿，数据管理。李萍： 软件开发。山桂松： 方法学设计。潘晓茹： 实验研究。陆学进： 方法学设计。王冉： 编写 – 审稿与编辑，监督。方婉清： 验证。张娟： 编写 – 原稿，概念构思。何晓燕： 编写 – 审稿与编辑，编写 – 原稿，监督。王婉荣： 编写 – 原稿，概念构思。李学乾： 编写 – 原稿，数据管理

利益冲突

作者声明没有竞争性财务利益。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向相应作者合理请求获得。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（82572392）、安徽省自然科学基金（2508085MH213）以及安徽省高等学校自然科学研究项目（2025AHGXZK30924）的支持。

王婉荣|张娟|李学乾|穆思琪|熊艳|山桂松|李萍|潘晓茹|方婉清|王冉|何晓燕