七甲脒花青素作为光控迈克尔试剂，用于实现GPX4的时空特异性抑制及铁死亡免疫疗法

《Biomaterials》：Heptamethine Cyanines Serve as Photocaged Michael Electrophiles for Spatiotemporal GPX4 Inhibition and Ferroptosis Immunotherapy

　　

摘要

抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）以诱导铁死亡（ferroptosis）已成为克服药物抗性的关键策略。然而，传统的GPX4抑制剂（通常是α-氯乙酰胺）在稳定性和靶向性方面存在局限性，这限制了其作为药物开发的应用。我们发现，七甲撑氰化物（Cy7）可作为光启用的迈克尔electrophile（photo-coded Michael electrophile），能够在亚微摩尔到纳米摩尔浓度范围内实现对GPX4的时空特异性抑制并诱导铁死亡，无论是对亲本细胞还是耐药癌细胞都有效。其强烈的光毒性源自这些光启用的迈克尔electrophile的优化电活性窗口，这种电活性使得它们能够选择性地与GPX4中的硒半胱氨酸（selenocysteine）反应，而非谷胱甘肽（GSH），从而绕过了细胞的GSH解毒机制。此外，Cy7染料的结构可调性使得能够根据需要制备针对特定癌细胞的GPX4抑制剂。例如，我们开发了一种酶激活型Cy7前体药物，在光照射下能够选择性杀死原发性肿瘤中的癌细胞，并同时激发全身性的抗肿瘤免疫反应，从而抑制远处肿瘤的生长。这项工作为GPX4抑制剂的发展开辟了新途径，并重新利用了传统的Cy7成像载体作为抗癌剂。

引言

铁死亡是一种受调控的细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化物的积累，这一术语最早由Dixon等人于2012年提出。这种细胞死亡机制始于铁催化的羟基自由基（HO^•）的生成，这些自由基会从膜多不饱和脂肪酸（PUFA）的双烯丙基亚甲基单元中夺取一个氢原子，形成共振稳定的碳中心PUFA自由基（PUFA•）（图1A）。铁死亡的传播阶段涉及PUFA•的氧化链反应，导致脂质过氧化（LPO）和大量脂质过氧化物（PUFA-OOHs）的生成。执行阶段的特点是PUFA-OOH分解为脂质衍生的electrophile（LDEs）和截短的磷脂（PLs）。LDEs，尤其是4-羟基壬烯醛（4-HNE），主要包括迈克尔electrophile，它们可以通过迈克尔加成反应使多种含硒半胱氨酸的蛋白质失活，例如谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多药抗性相关蛋白（MRP），这些蛋白质在保护细胞免受铁死亡方面起着关键作用。例如，GPX4利用谷胱甘肽（GSH）作为辅因子将细胞毒性的PUFA-OOH还原为非细胞毒性的PUFA-OHs，从而防止 lipid 过氧化；而GST则通过形成GSH-LDE加合物将其解毒，并通过MRP转运到细胞外。这些蛋白质的失活，特别是GPX4的失活，会通过正反馈机制导致PUFA-OOHs、LDEs和截短PLs的积累，最终引发细胞膜通透性和铁死亡。临床前研究表明，铁死亡在多种疾病中起着重要作用，如退行性疾病（帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病）、缺血-再灌注损伤以及癌症。这种广泛的疾病相关性引发了大量研究，人们试图寻找铁死亡调节因子，如金属螯合剂去铁胺（deferoxamine）、去铁酮（deferiprone）、去铁罗司（deferasirox）和环吡咯昔（cyclopirox），这些药物已在临床应用中显示出通过抑制LPO来调节铁死亡的效果。在癌症领域，这种兴趣尤为突出，因为越来越多的证据表明铁死亡在杀死癌细胞（尤其是耐药癌细胞）中起着重要作用。

尽管可以通过多种机制诱导铁死亡，但最直接的方法是共价修饰GPX4的催化硒半胱氨酸（Sec）残基。通过这种机制起作用的抑制剂（如RSL3和ML162，图1B）通常是烷基氯electrophile（如α-氯乙酰胺）。然而，这类抑制剂通常缺乏稳定性、选择性和靶向性，限制了其成药潜力。为克服这些局限性，近年来开发了几类新的GPX4抑制剂，包括硝基异噁唑（如ML210）、α-硝基酮肟（如JKE1674）、硝基酸（如JKE1716）和二酰氟烷（如NSC144699，图1B）。这些抑制剂作为掩蔽的腈氧化物electrophile，在细胞内被激活后生成活性腈氧化物物种，与GPX4的硒半胱氨酸残基共价结合。虽然其细胞内激活的具体机制尚未完全阐明，但这些掩蔽的腈氧化物electrophile对GPX4的选择性有所提高，在某些情况下表现出比激活的烷基氯更好的生化和药代动力学特性。尽管如此，仍需进一步研究以评估它们的癌细胞特异性及其体内的抗肿瘤活性。此外，尽管在过去二十年中投入了大量努力开发GPX4抑制剂作为潜在抗癌药物，但由于副作用（包括免疫细胞死亡、骨髓损伤、肝肾损伤和恶病质），取得的成功有限。总体而言，迫切需要更高效的GPX4抑制剂来开发抗癌药物，例如那些具有更好时空可控性和肿瘤特异性的抑制剂，以减少副作用。

在这项工作中，我们首次证明七甲撑氰化物（Cy7）染料可作为光启用的迈克尔electrophile，用于实现GPX4的时空特异性抑制和铁死亡诱导。这一策略的灵感来源于Cy7染料本身的光稳定性较差特性，这使得它们在近红外（NIR）照射下会释放出活性迈克尔electrophile（图1C）。这些被称为Cy7-衍生的electrophile（CyDEs）的化合物具有与铁死亡执行阶段产生的高毒性LDEs相似的Michael活性结构，从而为GPX4的烷基化和铁死亡诱导提供了结构基础。通过一系列Cy7染料实验验证了该策略的有效性和通用性，这些染料在生物相容性低功率NIR激光照射（750 nm，80 mW cm^?2，10分钟）下对亲本细胞和耐药癌细胞均表现出高光毒性，半数抑制浓度（IC₅₀）处于亚微摩尔到纳米摩尔范围。机制研究表明，这些Cy7染料的光毒性主要来源于一类特定的光启用的迈克尔electrophile，它们能够绕过GSH的解毒作用，直接与GPX4中的硒半胱氨酸残基发生烷基化反应。此外，Cy7染料还具有良好的NIR荧光性和耐缺氧光毒性：前者有助于实现GPX4的时空特异性抑制，后者则适用于治疗缺氧型实体肿瘤。重要的是，Cy7染料的结构可调性使其能够制备多种针对特定癌细胞的GPX4抑制剂。作为概念验证，我们开发了一种酶激活型Cy7前体药物，在NIR光照射下能够选择性杀死原发性肿瘤中的癌细胞，同时不损伤正常细胞，并激发强烈的抗肿瘤免疫反应，抑制远处肿瘤的生长。

章节片段

结果与讨论

设计原理：Cy7染料是一类出色的荧光团，在现代荧光成像技术中得到广泛应用，因为它们具有优异的光物理性质，如NIR吸收和发射波长（750–850 nm）、高荧光强度以及极高的摩尔消光系数（ε：通常 > 2.0 × 10⁵ M^?1 cm^?1）。此外，这类染料具有良好的生物相容性（例如ICG²⁷和OTL38）。

结论

总结来说，受到铁死亡执行阶段产生的LDEs的细胞毒性机制启发，我们提出了一种实现GPX4时空特异性抑制和铁死亡诱导的创新策略。该策略利用Cy7染料本身的光稳定性差的特性，生成能够通过共价抑制GPX4诱导癌细胞铁死亡的Michael electrophile。从这个意义上讲，广泛使用的Cy7染料可以被视为被光激活的Michael electrophile。

CRediT作者贡献声明

张卓军：验证、软件开发、实验研究。刘梦星：验证、软件开发、实验研究。刘静：初稿撰写、项目监督、实验管理、资金获取、数据分析、概念构思。孙远强：验证、实验研究。张宏兴：验证、实验监督、方法论设计、资金获取。郭伟：修订与编辑、项目监督、方法论设计、资金管理。

数据可用性声明

数据将根据需求提供。

潜在的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能影响本文研究的潜在利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：22277070、22274091、22007061）、山西省自然科学基金（项目编号：202403021211019）、山西省科技创新人才团队基金（项目编号：202304051001002）以及山西省光化学功能分子重点实验室的支持。

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