《Biomass and Bioenergy》：Single-step pretreatment enables direct fermentation and accelerated methanogenesis from spent coffee grounds
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咖啡加工、烘焙和风味提取过程中产生的固体残渣是富含碳和能量的生物质资源，具有作为生物燃料和增值化合物可持续生产原料的巨大潜力。据Murthy和Madhava Naidu报道，加工1 kg生咖啡豆约产生0.65 kg咖啡渣（SCG），这是速溶咖啡生产和冲泡咖啡制
咖啡加工、烘焙和风味提取过程中产生的固体残渣是富含碳和能量的生物质资源，具有作为生物燃料和增值化合物可持续生产原料的巨大潜力。据Murthy和Madhava Naidu报道，加工1 kg生咖啡豆约产生0.65 kg咖啡渣（SCG），这是速溶咖啡生产和冲泡咖啡制备的主要副产品。基于全球咖啡消费量，估计全球每年产生约600万吨SCG。尽管其具有增值潜力，但很大一部分SCG仍未得到充分利用，每年约有580万吨被填埋处置。工业SCG（速溶咖啡生产的副产品）和家庭SCG（咖啡冲泡过程中产生）作为循环经济、废物转能源和生物精炼策略中的潜在原料日益受到关注。尽管对其增值利用的兴趣日益增长，但大部分SCG仍被填埋或焚烧，这些做法与减少温室气体排放和环境污染的全球努力相冲突。填埋会促进SCG的不受控降解，导致水污染和甲烷（一种强效温室气体）排放。焚烧也引发环境担忧，因为SCG燃烧可产生有毒化合物和温室气体。许多研究强调了通过热化学过程（包括气化、热解和燃烧）将SCG转化为生物能源和生物燃料的潜力，这符合废物转能源的概念。然而，SCG的高含水量仍是主要挑战，增加了运输和处理成本。近年来，注意力转向利用SCG生产沼气和回收增值中间体。特别是，多项研究探讨了SCG与其他有机废物的厌氧共消化。甲烷生产也受到关注，因为它可以整合到更广泛的生物精炼策略中，其中发酵和厌氧消化等生物过程与热化学技术和生化提取过程相结合，以最大化资源回收和SCG的整体价值。先前研究已证明SCG用于甲烷生产的潜力。然而，尽管SCG固体部分（无论未处理还是碱法脱脂）在生物燃料生产方面具有前景，但其高度顽固的结构限制了高效转化，通常导致消化时间延长。因此，SCG厌氧消化的主要瓶颈不是其甲烷产率潜力，而是生物质顽固性导致的缓慢降解动力学。优化基质与接种物比例和固体浓度可以防止抑制并提高甲烷产量，但不足以克服缓慢的工艺速率。这些局限性表明需要有效的预处理步骤来破坏SCG的顽固性并在转化前增强糖回收。然而，尽管预处理方法可以有效地从SCG释放可发酵糖，但它们可能同时产生抑制性化合物（包括酚类和呋喃类），这会损害微生物代谢和发酵性能。为克服这一限制，本研究采用了对这些抑制剂具有增强耐受性的进化酵母菌株，从而能够从SCG水解液中高效生产乙醇。具体而言，进化的马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）菌株用于乙醇发酵，而混合接种物用于甲烷生产。虽然咖啡渣已被研究用于沼气生产，但其结构顽固性通常导致缓慢的消化动力学。此外，从SCG进行常规糖回收通常依赖昂贵的酶水解或水解液脱毒。在此，研究人员而非提出新的化学试剂，报告了一种集成的单步稀酸级联生物精炼，克服了两个瓶颈：使用进化酵母从液体流中实现直接、非脱毒的生物乙醇发酵，同时加速残留固体流的甲烷生产动力学。因此，本研究提出通过稀酸预处理对SCG进行分馏，以产生两个增值流：富含糖的水解液（SCG-H）用于使用对水解液衍生抑制剂具有增强耐受性的进化酵母菌株生产乙醇，以及预处理固体部分（HSCG）用于使用混合接种物生产甲烷。还对接种物的微生物群落进行了测序，以鉴定参与过程的主要属。能够高效转化非脱毒SCG水解液的稳健发酵微生物与剩余固体部分增值用于加速甲烷生产的组合，为最大化SCG利用提供了集成方法。该策略通过增强资源回收、最小化残留废物以及潜在地改善SCG生物加工的经济和环境可持续性，支持基于SCG的生物精炼的发展。
研究背景方面，咖啡加工过程中产生的咖啡渣（SCG）是富含碳和能量的生物质资源，全球每年产生约600万吨，其中约580万吨被填埋处置，导致水污染和甲烷排放等环境问题。SCG的高含水量增加了热化学转化的运输和处理成本，而厌氧消化（AD）虽可实现甲烷生产，但SCG的高度顽固结构导致降解动力学缓慢，成为其主要瓶颈。优化基质与接种物比例和固体浓度虽可提高甲烷产量，但不足以克服缓慢的工艺速率。预处理虽可有效释放可发酵糖，但可能产生酚类和呋喃类等抑制性化合物，损害微生物代谢和发酵性能。因此，研究人员旨在开发一种集成的单步稀酸级联生物精炼策略，利用对抑制剂具有增强耐受性的进化马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）菌株从非脱毒水解液中直接发酵生产乙醇，同时加速残留固体部分的甲烷生产动力学，从而实现SCG的完全增值利用。
研究人员开展了以下研究：以巴西Cocam公司提供的工业SCG为原料，采用稀硫酸预处理（100 mg H?SO? g?1干SCG，液固比10:1，163 °C，60 min）制备水解液（SCG-H）和预处理固体（HSCG）；使用经适应性实验室进化（ALE）获得的耐热马克斯克鲁维酵母菌株进行乙醇发酵；以家禽屠宰废水处理的上流式厌氧污泥床（UASB）反应器的厌氧颗粒污泥为接种物进行厌氧消化产甲烷；并对接种物微生物群落进行16S rRNA基因测序分析。结论显示，该级联策略实现了乙醇产量0.47 gC-ethanol g?1C-sugars（70.5%理论转化率）和甲烷产量301.14 ± 7.64 mL CH? g?1VS，较未处理SCG提高29%，产甲烷速率提高55%。该研究的重要意义在于：通过单步预处理实现了非脱毒水解液的直接发酵和残留固体的加速产甲烷，克服了传统方法对酶水解和脱毒的依赖，为SCG的完全资源化利用提供了可复制的废物转能源生物精炼模型，支持循环生物经济发展。
关键技术方法方面，研究人员主要采用：（1）稀硫酸单步预处理对SCG进行分馏，条件为100 mg H?SO? g?1干SCG、液固比10:1、163 °C、60 min；（2）适应性实验室进化（ALE）获得的耐热马克斯克鲁维酵母菌株用于非脱毒SCG水解液的乙醇发酵，发酵条件为40 °C、200 rpm、72 h，设置不同工作体积（50、80、110 mL）以调控供氧；（3）以家禽屠宰废水UASB反应器颗粒污泥为接种物的中温厌氧消化产甲烷测定，接种物与基质比（ISR）为1.36 g VS_inoculum/g VS_substrate；（4） modified Gompertz模型拟合甲烷产量数据；（5）16S rRNA基因扩增子测序（细菌341F/785R引物，古菌Ar915aF/Ar1386R引物）分析微生物群落；（6）基于1 kg干SCG的初步能量平衡计算。
研究结果方面：
3.1 合成培养基中的乙醇生产：通过调控工作体积控制通气量，发现较高通气量（较低工作体积）有利于生物量形成，而氧限制条件有利于乙醇生产。合成糖混合物在110 mL工作体积下乙醇产量达9.64 g L?1，证实了呼吸代谢与发酵代谢之间的清晰转换。
3.2 咖啡渣水解液中的乙醇生产：非脱毒水解液含32.8 ± 0.8 g L?1总糖（以甘露糖当量计），抑制剂包括1.60 ± 0.22 g L?1糠醛、1.07 ± 0.13 g L?1乙酰丙酸、1.02 ± 0.14 g L?1甲酸、0.34 ± 0.29 g L?1乙酸和721.8 ± 38 mg GAE L?1总酚类。糠醛浓度超过非适应酵母菌株的显著抑制阈值，为使用ALE进化菌株提供了直接定量依据。细胞生长在SCG-H中不受工作体积显著影响，表明水解液组成（而非供氧或Na?浓度）是限制细胞生长的首要因素。乙醇产量随工作体积增加而增加，在110 mL时达8.54 ± 0.24 g L?1，产率0.47 g g?1。甘油产量随工作体积增加而降低，乙酸产量则增加。最高乙醇浓度8.54 ± 0.24 g L?1、产率0.47 g g?1（70.5%效率）、生产率1.22 g L?1 h?1，且无需酶水解或脱毒，优于或可比于文献报道的SCG乙醇发酵结果。
3.3 厌氧消化与甲烷生产：未处理SCG的甲烷产率为233.16 ± 14.83 mL CH? g?1VS，产甲烷速率为39.64 ± 3.63 mL CH? g?1VS d?1；HSCG的甲烷产率为301.14 ± 7.64 mL CH? g?1VS，产甲烷速率为61.62 ± 2.60 mL CH? g?1VS d?1，较未处理SCG分别提高约29%和55%。尽管预处理去除了大量糖类（半纤维素从25.34%降至4.45%），残留固体部分仍表现出更高的甲烷产率和速率，表明稀酸预处理增加了剩余有机物的可及性和生物降解性。
3.4 微生物群落：SCG（无论是否预处理）均显著改变了AD过程中的微生物群落，增加了关键互养产乙酸细菌类群（Anaerolineaceae、Syntrophobacter、Longilinea、Mesotoga）的相对丰度，同时降低了Pseudomonas和Sulfurimonas的丰度。细菌群落的这种变化伴随着乙酸营养型产甲烷菌丰度的增加和氢营养型产甲烷菌的减少。HSCG保留了富集这些功能相关微生物类群的能力，表明稀酸预处理未损害且可能有利于参与甲烷生产的互养微生物相互作用的建立。Anaerolineaceae从接种物的5.95%增至未处理SCG的8.80%和预处理SCG的9.33%；Methanosaeta从4.30%增至12.55%（未处理SCG）和16.39%（预处理SCG）；Syntrophobacter从2.93%增至12.08%和11.17%；Longilinea从3.02%增至5.75%和6.29%；Mesotoga从2.40%增至4.72%和5.92%。
3.5 质量平衡与表征：稀酸预处理导致SCG质量损失15.28 ± 2.02%，主要由于半纤维素溶解。HSCG半纤维素含量从约25%降至约4.5%（减少82.5%），纤维素含量增加约10%，酸不溶残渣（AIR）增加，但质量平衡计算显示AIR绝对量增加约7%（重复A）和2.5%（重复B），不能仅由半纤维素去除的富集效应解释，这与酸预处理过程中假木质素（pseudo-lignin）形成的报道一致。脂肪含量增加约15%，表明脂质在预处理过程中大部分保留在固体部分。初步能量平衡基于1 kg干SCG：预处理热能输入估计为5.77 MJ kg?1 SCG；液体水解液发酵产生85.4 g乙醇 kg?1 SCG（2.29 MJ kg?1 SCG）；固体部分产生0.255 m3 CH? kg?1 SCG（9.13 MJ kg?1 SCG）；总可回收能量为11.42 MJ kg?1 SCG，占SCG原料能量含量（约22 MJ kg?1）的51.9%；过程能量比（可回收能量/预处理热能输入）约为1.98，表明联合生物精炼路线的能量产出约为预处理投入能量的两倍。作者也指出了局限性：发酵和厌氧消化均在实验室批次规模进行，需要在连续反应器（如CSTR）中验证长期运行稳定性；酸预处理需要耐腐蚀基础设施；乙醇浓度8.54 g L?1虽对非脱毒水解液具有竞争力，但低于蒸馏相关阈值，未来应探索补料分批策略以提高糖和乙醇浓度。从工业角度看，该级联生物精炼特别适合速溶咖啡制造工厂，那里现场产生大量SCG，消除了运输物流。回收的生物甲烷（0.255 m3 kg?1VS）可为热电联产单元供能，为预处理提供蒸汽，而生物乙醇提供二次生物燃料流，支持循环生物经济模式。
讨论部分总结：本研究证明了通过将稀酸预处理、乙醇发酵和厌氧消化整合到单一级联生物精炼框架中，实现SCG完全增值利用的高效率、低复杂度路线。水解液含33 g L?1糖，经进化耐热马克斯克鲁维酵母非脱毒发酵，实现8.54 ± 0.24 g L?1乙醇、产率0.47 gC-ethanol g?1C-sugars、70.5%理论转化率和生产率1.22 g L?1 h?1。水解固体部分尽管木质素含量增加27%，但顽固性降低，甲烷产率达301.14 ± 7.64 mL CH? g?1VS，产甲烷速率61.62 ± 2.60 mL CH? g?1VS d?1，较未处理SCG分别提高29%（以原始干SCG质量归一化约9%）和55%（同基准约32%）。未处理和预处理SCG均选择性富集互养微生物群落，特别是Anaerolineaceae、Syntrophobacter、Longilinea、Mesotoga和Methanosaeta，这些已知可增强反应器稳定性和效率。通过从单一木质纤维素残渣中回收两种能量载体（乙醇和甲烷），该策略最大化了能量产出，减少了废物处置影响，并为可持续废物转能源生物精炼提供了可复制的模型。
研究结论翻译：本研究证明了通过将稀酸预处理、乙醇发酵和厌氧消化整合到单一级联生物精炼框架中，实现SCG完全增值利用的高效率、低复杂度路线。水解液含33 g L?1糖，经进化耐热马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）非脱毒发酵，实现8.54 ± 0.24 g L?1乙醇、产率0.47 gC-ethanol g?1C-sugars、70.5%理论转化率和生产率1.22 g L?1 h?1。水解固体部分尽管木质素含量增加27%，但顽固性降低，甲烷产率达301.14 ± 7.64 mL CH? g?1VS，产甲烷速率61.62 ± 2.60 mL CH? g?1VS d?1，较未处理SCG分别提高29%（以原始干SCG质量归一化约9%）和55%（同基准约32%）。未处理和预处理SCG均选择性富集互养微生物群落，特别是Anaerolineaceae、Syntrophobacter、Longilinea、Mesotoga和Methanosaeta，这些已知可增强反应器稳定性和效率。通过从单一木质纤维素残渣中回收两种能量载体（乙醇和甲烷），该策略最大化了能量产出，减少了废物处置影响，并为可持续废物转能源生物精炼提供了可复制的模型。
