基于侧链工程的无需载体的近红外纳米光敏剂，具有双重细胞靶向性，适用于乳腺癌光动力疗法

《Bioorganic Chemistry》：Carrier-free near-infrared nano-photosensitizers with dual-cellular targeting based on side-chain engineering for breast cancer photodynamic therapy

　　我们构建了一个针对细胞溶酶体和线粒体的双靶点光疗系统。无载体的纳米光敏剂实现了完全装载，并且尺寸小于200纳米。聚集的光敏剂显著提高了I型/II型活性氧（ROS）的生成效率。TPP-nC-OH纳米光敏剂在肿瘤成像和光动力疗法（PDT）治疗中表现出良好的效果。

引言
乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的7%到10%[1],[2]。传统的治疗方法如手术、放疗和化疗可以在一定程度上控制肿瘤生长[3],[4],[5]，但这些方法通常会引发副作用，并且肿瘤细胞可能会发展出药物抗性，这对患者产生负面影响并导致治疗失败。因此，迫切需要寻找新的治疗方法来延长乳腺癌患者的生存期并改善他们的生活质量。光动力疗法（PDT）作为一种新兴的癌症治疗方法，近年来受到了越来越多的关注。PDT利用光敏剂（PSs）在特定波长下产生活性氧（ROS），从而选择性地杀死肿瘤细胞。与传统治疗方法相比，PDT具有微创性，副作用较少，并且可以保护周围的正常组织[6],[7],[8],[9]。此外，PDT在针对乳腺癌的治疗中也显示出良好的前景。

活性氧可以分为I型和II型。II型通过三重态激发的能量转移产生单线态氧（1O2），1O2是II型反应的主要产物，具有高氧化活性，可以有效诱导细胞凋亡或坏死。然而，这一过程需要一个富氧环境[10]。I型主要通过光诱导的电子转移产生自由基（如羟基自由基·OH、超氧阴离子O2•–和过氧化氢H2O2），对氧的依赖性较低[11],[12],[13],[14],[15],[16]。为了在不同氧水平下的肿瘤区域实现协同效应，并整合这两种途径的优势[17],[18],[19]，增强ROS的生成和治疗效果，并能够在复杂的肿瘤微环境中广泛发挥作用[20]，许多研究致力于开发能够同时产生I型和II型ROS的“双型”PSs。

传统的PSs通常会因聚集而出现荧光淬灭（ACQ），这限制了它们在活体系统中的应用[21],[22],[23]。然而，具有聚集诱导发射（AIE）特性的PSs通过其独特的分子结构克服了这一缺点。在聚集状态下，它们可以增强荧光和ROS的生成，从而改善传统PSs的性能[24]。AIE PSs在聚集时表现出更强的光致发光（PL）能力，这可以提高PDT的效率，并在成像引导下实现更精确的肿瘤治疗。因此，增强聚集诱导发射聚合物颗粒的ROS生成能力一直是提高PDT疗效的关键焦点。

此外，PDT的疗效不仅仅取决于ROS的生成。具有相似ROS生成能力的PSs可能会显示出明显不同的治疗效果[25],[26]，这主要是由于它们在细胞内的定位不同。PS所针对的具体细胞器决定了ROS诱导损伤的位置[27]，这是影响PDT疗效的重要因素。例如，溶酶体作为细胞内的酸性消化细胞器（pH 4–5），在细胞信号转导和能量代谢中起着作用。线粒体[28]作为细胞死亡的关键调节器，是特别有效的靶点。线粒体损伤可以有效地触发癌细胞死亡[29]，使针对线粒体的PSs在PDT中具有优势。因此，开发一种同时作用于溶酶体和线粒体的双靶点PDT PS是一个有前景的策略。这不仅可以增加PS在肿瘤细胞中的富集，还可以诱导线粒体功能障碍和细胞凋亡，从而提高PDT的疗效。由于线粒体带有负电荷，向PS中引入阳离子是实现特异性线粒体靶向的有效策略[30]，阳离子PS可以通过静电相互作用靶向线粒体。像三苯基膦（TPP）这样的非局部化亲脂性阳离子具有良好的脂溶性，并可以通过电化学梯度选择性地积聚在活细胞线粒体中[31],[32]。因此，近年来阳离子AIE PSs在光动力抗肿瘤治疗研究中得到了广泛应用。在PS中引入烷基链并调整侧链长度可以调节膜通透性。结合烷基链的阳离子PS可以通过强疏水相互作用牢固地锚定在线粒体内膜上，从而增强PS与线粒体的结合亲和力。侧链的设计不仅影响光敏剂的水溶性和生物相容性，还对其光敏性能有很大影响。Tang等人[30]发现，当线粒体膜电位（MMP）降低或消失时，长烷基链PS比短烷基链PS在線粒体中的保留时间更长，为具有强靶向保留能力的PS提供了一个新的思路。Wang和Zhou等人[33]合成了一系列三苯胺-吡啶盐分子，并发现吡啶基上的烷基链长度影响单线态氧的生成效率。这些研究表明，调节烷基链的长度可以调节线粒体靶向能力。然而，目前还没有系统研究ROS生成的调控机制。我们之前合成了链端带有羧基的阳离子PSs，这些PSs可以促进I型/II型ROS的生成。我们发现，长烷基链PS的膜通透性和靶向能力优于短烷基链PS，并且长烷基链PS可以与白蛋白自组装以促进线粒体靶向和ROS生成[17]。研究结果表明，通过引入具有强电子吸引能力的侧链，光敏剂的 photoactivity 提高，从而增强了其抗肿瘤效果。此外，侧链的聚集行为也可以调节光敏剂的AIE特性，从而影响其在肿瘤组织中的成像性能和治疗效果。因此，在这项工作中，我们系统地采用了侧链工程，合理设计并成功合成了八种不同的烷基链替换的阳离子AIE PSs，包括TPP-nC（n=10, 12）、TPP-nC-OH（n=6, 8, 10, 12）和TPP-nC-COOH（n=10, 12），并系统研究了侧链末端基团和长度对聚集、ROS生成和双细胞器靶向的影响。研究发现，较长的TPP-nC（n=10, 12）、TPP-nC-OH（n=10, 12）和TPP-nC-COOH（n=10, 12）可以在水环境中自组装成球形纳米颗粒并生成I型/II型ROS。值得注意的是，羟基的亲水性较高，TPP-nC-OH（n=10, 12）在水环境中形成的纳米颗粒显著小于其他两种末端基团的纳米颗粒，且聚集状态显著提高了光敏剂的发光效率。同时，TPP-nC的ROS生成能力不如链端带有羧基/羟基的PSs，这可能是由于TPP-nC在水中的溶解度较低。这项研究开发了一种双细胞靶向的AIE分子，它可以自组装成无载体的纳米级PSs，其中光敏剂本身构成了整个纳米颗粒基质。如图1所示，引入羟基增强了分子间相互作用力，使得纳米颗粒更小（<200纳米），并在聚集状态下具有最高的ROS生成效率。此外，由于TPP-nC-OH NPs对溶酶体具有出色的靶向能力，它促进了细胞对光敏剂的内吞作用。同时，它表现出强烈的线粒体靶向性能，有效降低了线粒体膜电位并促进了ROS的积累，从而诱导细胞凋亡。系统评估了TPP-nC-OH NPs的物理化学特性、细胞内化效率、体外光毒性和体内成像性能以及体内光动力疗效。研究结果表明，带有羟基末端的TPP-nC-OH表现出高ROS生成效率和在溶酶体和线粒体中的双细胞器定位。此外，在体内研究中观察到强烈的荧光成像能力和显著的抗肿瘤效果，表明TPP-nC-OH在肿瘤成像和PDT方面具有巨大潜力。

材料与仪器
DCFH-DA、Rose Bengal Red和Calcein AM购自Beyotime Biotechnology Co., Ltd. Dihydrorhodamine 123购自America MedChemExpress Co., Ltd. Mito Tracker Deep Red和Hydroxyphenyl Fluorescein（HPF）购自上海Maokang Biotechnology Co., Ltd. 9,10-Anthracenediyl-bis(methylene) dimalonic Acid（ABDA）购自Merck KGaA。1640培养基、双抗生素和0.25% trypsin购自Thermo Fisher Scientific Co., Ltd。胎牛血清（FBS）购自浙江。

合成与表征
基于具有增强供体-受体（D-A）强度、明亮发光和较高ROS量子产量的AIEgens，我们设计了一系列AIEgens，其结构包括一个吡啶基（作为A）、一个碳-碳双键（π-桥接基团）和一个三苯片段（D）。这种设计增强了D–A相互作用，从而确保了长寿命的荧光发射和高ROS量子产量。为了研究侧链的影响...

结论
总之，我们通过侧链工程策略设计并合成了两种具有双细胞器靶向和强I型/II型ROS生成能力的AIE PSs。通过引入不同长度和不同末端基团的侧链，系统地调整和优化了纳米颗粒在聚集状态下的光物理和光动力性能。这是由于不同的侧链导致了不同的分子间堆积状态。

在本文的准备过程中，作者没有使用任何AI工具。