从Menispermum dauricum DC中鉴定并表征一种针对μ和κ阿片受体的双重拮抗剂

《Bioorganic Chemistry》：Identification and characterization of a dual antagonist for mu and kappa opioid receptors from Menispermum dauricum DC

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  一种从Menispermum dauricum中提取的生物碱具有功能性双重MOR/KOR拮抗剂的作用。
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  通过FLIPR、DMR和cAMP实验验证了其MOR拮抗作用。
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  化合物1在DOR、NOPR以及五种经过筛选的GPCRs上均无活性。
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  化合物1代表了一种有前景的天然产物衍生骨架，可用于进一步优化。

引言

吗啡和其他阿片类生物碱化合物仍然是目前最有效的镇痛剂，被广泛用于治疗中度至重度疼痛[1]，[2]。它们的治疗作用主要是通过激活阿片受体实现的，其中μ-阿片受体（MOR）起着主导作用[3]，[4]。然而，长期使用阿片类药物会带来多种副作用，这些副作用会影响中枢和外周功能，包括胃肠道问题（统称为阿片诱导的肠道功能障碍OIBD），如便秘、腹痛和呕吐[5]。此外还包括非胃肠道效应，如身体依赖性、镇静作用、耐受性和呼吸抑制。OIBD是由于胃肠道内的MOR受体被激活引起的。目前的治疗主要依赖对症治疗，尤其是使用泻药来缓解便秘。尽管泻药是最常用的干预措施，但由于它们无法拮抗胃肠道中的MOR介导的信号传导，因此效果有限且常常会减弱[6]。

一个更合理的方法是直接拮抗外周的MOR受体，同时保护中枢神经系统（CNS）中的MOR受体[7]。这一策略利用了MOR受体在中枢和外周的分布差异：胃肠道中的阿片受体负责介导外周的不良反应，而中枢的镇痛作用主要由CNS中的MOR受体介导。通过利用物理化学性质限制药物穿过血脑屏障的能力，外周作用的MOR拮抗剂（PAMORAs）可以在不损害中枢镇痛效果的情况下逆转外周的阿片效应。这种治疗策略提供了一种基于机制的替代方案，并已通过多种PAMORAs的临床批准得到了验证[8]，[9]。然而，目前批准的PAMORAs仍存在一些显著的限制，例如甲基纳曲酮（methylnaltrexone）、纳洛酮羟乙基胡椒碱（naloxegol）和纳尔德美丁（nardemedine）。甲基纳曲酮虽然有口服制剂，但由于其口服生物利用度低，仍需皮下给药以实现较高的全身暴露[10]。纳洛酮羟乙基胡椒碱的暴露易受CYP3A抑制剂/诱导剂的影响，而纳尔德美丁则由CYP3A4代谢并通过P-糖蛋白（P-gp）转运，这可能导致与常用药物的临床显著相互作用[11]，[12]。更根本的是，现有的PAMORAs依赖有限的化学策略来实现外周限制，其临床开发主要集中在阿片引起的便秘问题上。这些限制凸显了新型MOR拮抗剂在药物化学方面的需求：需要围绕外周限制药效团进行更大的结构多样性优化，以提高口服暴露量和代谢稳定性，并将治疗作用扩展到更广泛的OIBD症状范围。这一持续存在的空白表明迫切需要能够对抗不希望出现的阿片作用的创新拮抗剂。

阿片类生物碱，如吗啡和可待因，属于异喹啉类生物碱。这类生物碱分布广泛且种类繁多，主要存在于Menispermaceae、Berberidaceae、Papaveraceae等科植物中[13]，[14]。其中Menispermum dauricum DC（Menispermaceae科）在中国广泛分布，其根茎被用作传统中药“北豆根”，具有镇痛和退热作用。我们之前对Menispermum dauricum DC中与镇痛相关的G蛋白偶联受体（GPCRs）的植物化学研究分离出一系列异喹啉类生物碱，这些生物碱能够拮抗多巴胺D1、毒蕈碱M3和MOR受体[15]，[16]，[17]。鉴于阿片受体、多巴胺受体和毒蕈碱受体都参与疼痛调节，且Menispermum dauricum DC中的生物碱已经显示出与MOR受体结合的能力，这些发现支持进一步探索该植物中的活性成分。然而，这些生物碱的阿片受体亚型特性尚未得到系统研究。因此，对Menispermum dauricum DC中的化合物进行MOR受体选择性测试是有必要的，以鉴定新的候选化合物并确定其阿片受体选择性。

除了MOR受体外，κ-阿片受体（KOR）也成为应激相关疾病和物质使用障碍治疗领域的关注目标。 dynorphins激活KOR与应激引发的强迫性药物寻求和复发行为有关，而KOR拮抗剂被认为可以减轻这些行为[18]。最近的一项虚拟筛选发现了双重MOR拮抗剂/反向KOR激动剂异喹啉化合物，这类化合物能够逆转吗啡引起的镇痛效果，同时引起的戒断症状比纳洛酮轻，并减少条件性位点厌恶[19]。同样，双重选择性MOR/KOR拮抗剂NFP能有效拮抗吗啡的作用，同时产生的戒断症状明显少于纳洛酮[20]。这些发现表明，双重MOR/KOR拮抗剂可能具有互补的治疗效果。

在这项研究中，我们首先使用FLIPR实验建立了针对四种阿片受体的高通量筛选模型。随后，我们评估了20种从Menispermum dauricum DC中提取的化合物对MOR受体的作用，最终鉴定出一种新的MOR拮抗剂。其活性通过多种药理学技术得到了验证，包括无标记表型动态质量重分布（DMR）实验和基于cAMP的检测实验。亚型选择性分析进一步显示，该化合物还能拮抗KOR受体，而在δ-阿片受体（DOR）或nociceptin/orphanin FQ受体（NOPR）上无活性。我们还对其对其他五类GPCR靶点的选择性进行了评估。通过分子对接和分子动力学模拟预测了其与MOR受体的结合模式，并确定了关键的相互作用残基。总之，我们的研究扩展了阿片受体配体的天然库，并鉴定出一种具有进一步治疗开发潜力的双重MOR/KOR拮抗剂骨架。

章节片段

材料

Endomorphin-1、SNC80、MCOPPB、NOR-BNI和BANORL24从Tocris Biosciences（美国Ellisville）购买。纳洛酮和纳洛酮羟乙基胡椒碱从MedChemExpress（中国上海）购买。Hank's平衡盐溶液（HBSS）、HEPES和Ham's F12K培养基来自Thermo Fisher Scientific（美国Grand Island）。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和McCoy's 5A培养基从VivaCell Biosciences（中国上海）购买。胎牛血清（FBS）来自武汉Pricella。

使用FLIPR实验分析已知阿片受体亚型的特征

阿片受体主要包括四种亚型：MOR、DOR、KOR和NOPR，属于G蛋白偶联受体（GPCR）超家族。为了建立阿片受体配体的高通量筛选模型，我们在表达不同亚型阿片受体的四种细胞系上进行了FLIPR实验。使用的激动剂和拮抗剂包括：特异性MOR受体拮抗剂endomorphin-1和纳洛酮，特异性DOR受体拮抗剂SNC80和纳洛酮羟乙基胡椒碱，以及特异性KOR受体拮抗剂salvinorin A和NOR-BNI。

讨论

在本研究中，我们从Menispermum dauricum DC中鉴定出化合物1，这是一种新型MOR拮抗剂。从结构上看，化合物1与先前报道的MOR拮抗剂化合物(1R, 1′R-espinin)[15]具有相同的骨架，但在R4和R5位置有所不同（图2）：化合物1在这两个位置上都含有甲基，而(1R, 1′R-espinin在这些位置上含有氢。在功能实验中，化合物1显示出...

结论

总结来说，我们从Menispermum dauricum DC中鉴定出一种天然生物碱化合物1，它是一种功能性双重MOR/KOR拮抗剂。化合物1在MOR受体上的拮抗活性表现为低微摩尔浓度的IC50值，并且在三种正交实验（FLIPR、DMR和cAMP）中均得到了一致验证。亚型选择性分析进一步表明，该化合物还能拮抗KOR受体，而在DOR或NOPR受体上无活性。

CRediT作者贡献声明

Jiaqi Huo：撰写 – 审稿与编辑，研究，概念构思。Fangfang Xu：撰写 – 初稿撰写，研究，资金筹集。Jixia Wang：研究，资金筹集，概念构思。Tao Hou：研究。Yanfang Liu：资源支持，概念构思。Xiaomin Xie：研究。Cheng Wang：数据管理。Yang Han：撰写 – 审稿与编辑，资源支持，研究。Ling Ding：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本项目得到了以下机构的支持：中国国家自然科学基金（82374021）、中国博士后科学基金（2025M773917）、江西省赣鄱人才支持计划-重点学科学术技术带头人培训项目（2024351159BCE）、江西省自然科学基金（20224ACB216020）以及内蒙古自治区自然科学基金（2024QN08041）。

Jiaqi Huo|Fangfang Xu|Jixia Wang|Tao Hou|Yanfang Liu|Xiaomin Xie|Cheng Wang|Yang Han|Ling Ding

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