嗜热微生物电解池处理发酵甘蔗酒糟过程中的微生物群落演替与生物膜发育

《Microbiology Research》：Thermophilic Microbial Community Succession and Biofilm Development in a Microbial Electrolysis Cell Fed with Fermented Sugarcane Vinasse

　　

嗜热微生物电解池（MECs）可能将废水处理与氢气生产相结合，但其性能受微生物动态变化的影响尚不明确。本研究考察了在55°C条件下运行132天的单室MEC，以发酵甘蔗酒糟为底物，分别在0.8 V、0.9 V和1.1 V电压下运行，研究了微生物群落演替和生物膜发育。通过气体分析、扫描电子显微镜（SEM）以及对悬浮液和电极附着生物质的16S rRNA基因扩增子测序，评估了产氢性能和微生物定殖情况。在0.8 V条件下，气相中H2占比达94.7%，面积归一化产氢速率（PSA）为30.4 L H2 m?2 d?1。在1.1 V运行时，这些参数分别达到96%和55.4 L H2 m?2 d?1。显微观察证实了碳毡阳极在运行结束时已被定殖。群落发生了显著演替：Akkermansia和Pseudomonas短暂富集，Caldanaerobius在0.8 V时占据主导地位，而Moorella在最终阶段成为优势菌属，分别占悬浮群落和电极附着群落的41.4%和44.9%。Thermoanaerobacterium在电极附着群落中的相对丰度高于悬浮生物质（18.4%对8.1%）。这些结果表明，长期嗜热运行选择了一个由发酵菌、产乙酸菌以及潜在的电报相互作用菌群组成的专业化联合体，同时支持了从发酵酒糟中高效产氢。

研究背景

甘蔗乙醇生产会产生大量酒糟，这是一种酸性强、营养丰富且有机负荷高并随季节变化的液态残留物。每升乙醇约产生10至18升酒糟，其管理是甘蔗精炼厂面临的主要环境和运营挑战。酒糟通常通过施肥灌溉应用于农业土壤，以回收水和养分，尤其是钾。然而，重复或过量施用可能导致盐渍化、养分失衡、土壤酸化、地下水污染以及温室气体排放失控等问题。这些局限性促使研究人员开发既能减轻污染又能资源回收的可控工艺。因此，酒糟被研究作为生产生物能源、有机酸、肥料、微生物生物量和其他增值产品的原料。其中，生物过程是主要的增值途径，而生物能源回收是主要研究方向之一。

酸发酵是将有机物转化为H₂和可溶性代谢物（包括乙酸盐、乳酸盐、甲酸盐等）的关键初始步骤。然而，由于大部分底物仍以还原性代谢物形式存在于液相中，产氢发酵的化学需氧量（COD）去除率有限。因此，发酵后的酒糟可被视为一种保留了相当化学能的中间原料。微生物电解池（MEC）提供了一种回收这部分残余能量的手段。在MEC中，微生物在阳极氧化有机化合物并将电子传递到外电路，同时施加电压促进阴极析氢。由于发酵产物的氧化降低了产氢所需的热力学电输入，MEC可以在比传统水电解更低的电压下运行，特别适合作为酸发酵的下游环节。

尽管已有研究证明了在嗜温双室MEC中利用未发酵酒糟直接进行生物电化学产氢的可行性，但并未考察微生物群落组成或时间动态。此外，其膜分隔和嗜温构型无法解释发酵酒糟如何在嗜热单室系统中影响微生物筛选。嗜热运行可能为整合进甘蔗精炼厂带来额外优势，因为酒糟离开蒸馏过程时的温度接近90°C，因此在55°C附近进行处理可以减少冷却需求。虽然已在其他高强度工业废水中证明了嗜热发酵与微生物电解集成系统的可行性，但来自这些废水的证据不能直接外推到发酵甘蔗酒糟，因其具有独特的有机和矿物组成。

嗜热MEC的性能不仅取决于反应器构型、底物组成、温度和施加电压，还取决于负责发酵、代谢物氧化、产氢/耗氢以及向阳极传递电子的微生物的建立。重要的是，液体中悬浮的微生物种群可能与电极附着的种群不同。这种区室化表明，仅分析悬浮生物质可能无法充分代表与电极过程相关的微生物。施加电压也会改变嗜热MEC辅助系统中的微生物富集，尽管某些操作构型可能有利于产甲烷而非净H₂积累。此外，电活性微生物在系统发育上是多样化的，它们可能通过外表面细胞色素、导电结构、可溶性介体或其他机制交换电子，而这些无法仅从分类学身份推断。

尽管已有报道证明了嗜热MEC处理模型底物和复杂发酵废液的可行性，但其长期微生物演替仍未得到充分表征。特别是，尚未发现有研究同时评估了在以发酵甘蔗酒糟为底物的嗜热MEC中，H₂产量、代谢物转化、时间群落发展以及悬浮和电极附着种群之间的分化。研究人员假设，在55°C下长期运行将选择出一个专门的微生物联合体并促进阳极生物膜的形成，群落演替伴随着电流产生、代谢物转化和净H₂产量的变化。

研究方法

本研究采用单室无膜嗜热MEC，在55°C下以发酵甘蔗酒糟为底物，在0.8 V、0.9 V和1.1 V的连续施加电压下运行132天。接种物来自巴西圣保罗州Franca市市政污水处理厂的活性污泥。关键方法包括：气体成分的气相色谱（GC）分析；乳酸、乙酸和甲酸浓度的高效液相色谱（HPLC）测定；通过测量10Ω精密电阻上的电压降计算电流密度；使用扫描电子显微镜（SEM）观察碳毡阳极上的生物膜形态；以及通过16S rRNA基因（V4区域）扩增子测序分析微生物群落，测序平台为Illumina NovaSeq 6000。序列数据使用QIIME 2流程处理，基于SILVA 138数据库进行分类鉴定。

研究结果

3.1 嗜热MEC性能与产氢

在0.8 V运行时，H₂摩尔分数从最初批次逐步提升至B8批次的94.7%，此时面积归一化产氢速率（P_SA）达到30.4 L H₂ m^?2 d^?1，体积归一化产氢速率（P_VOL）为0.85 L H₂ L^?1 d^?1。同时观察到H₂损失率下降。当电压升至0.9 V时，H₂含量暂时下降后恢复至约91%。在1.1 V下，H₂摩尔分数达到96%，最大P_SA和P_VOL分别增至55.4 L H₂ m^?2 d^?1和1.55 L H₂ L^?1 d^?1，并记录了最高电流密度峰值和单批次最大累积H₂体积。

3.2 净代谢产物生产与消耗

在0.8 V下，乙酸盐在多数批次中表现为净产生，但在B8转为轻微净消耗。乳酸和甲酸盐的产生与消耗模式交替出现。电压升至0.9 V后，乙酸盐在所有批次（B9-B13）中均被净消耗，而乳酸和甲酸盐则净产生。在1.1 V下，乙酸盐继续被消耗，乳酸产生，甲酸盐在B14净产生而在B15净消耗。

3.3 嗜热MEC运行期间的微生物演替

门水平群落变化： 活性污泥接种物组成异质性高，以厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）和放线菌门（Actinobacteriota）为主。运行初期，疣微菌门（Verrucomicrobiota）和变形菌门先后短暂主导。到B8时，厚壁菌门占比约97%。最终阶段，厚壁菌门在悬浮和电极附着群落中分别占约79%和86%。

属水平微生物演替： 接种物中没有单一属超过6%。在0.8 V下，Akkermansia（B3，48.7%）和Pseudomonas（B4，51.3%）先后短暂主导，随后Caldanaerobius在B8达到87.4%的极高丰度。在0.9 V下（B13），Bacillus（28.8%）和Clostridium sensu stricto 1（10.4%）富集。最终阶段（B15），Moorella在悬浮（41.4%）和电极附着（44.9%）群落中均占主导地位。Thermoanaerobacterium在电极附着群落中的丰度（18.4%）显著高于悬浮群落（8.1%）。

Alpha多样性： 接种物多样性最高（Shannon指数7.63）。启动后所有指标大幅下降，B8时最低（Shannon指数2.08），对应Caldanaerobius的高度主导。后期多样性回升，B14时甚至超过接种物。电极附着群落的多样性低于同期悬浮群落。

Beta多样性： 主坐标分析（PCoA）显示，接种物与MEC运行期间的所有样品明显分离。0.8 V下的样品（B3, B4, B8）聚集在一起。后期样品（B13, B14）发生位移。最终悬浮和电极附着群落（B15-L, B15-E）彼此分离，表明两者组成存在差异。

3.4 碳毡阳极上的生物膜发育

SEM图像显示，未使用的碳纤维表面光滑。相比之下，运行结束后的生物阳极显示出广泛但不均匀的微生物细胞和聚集物覆盖。高倍镜下可见杆状细胞附着于碳纤维表面。

讨论与结论

讨论总结： 研究表明，嗜热MEC的性能随着批次运行逐步提升，在1.1 V时达到最高产氢效率。与前期相同构型的嗜温MEC相比，嗜热运行在0.8 V下的面积和体积产氢速率提高了约2.4倍，表明嗜热条件有利于从发酵酒糟中高效产氢。代谢物动态显示，发酵和阳极底物氧化同时发生，乙酸盐是连接发酵与电流驱动产氢的关键中间体，但乳酸和甲酸盐也参与了复杂的微生物相互作用。顶空H₂的后峰值下降暗示了可能的H₂循环或同型产乙酸作用。

微生物群落经历了显著的生态选择，早期由Akkermansia和Pseudomonas等过渡性种群主导，随后被更明确的嗜热菌Caldanaerobius取代，其高度主导性与0.8 V下最佳产氢性能吻合。最终阶段，群落由Moorella和Thermoanaerobacterium主导。Moorella在悬浮和电极附着群落中丰度相似，提示其主要参与悬浮或生物膜相关的产乙酸和发酵作用，而非特异性电极附着。而Thermoanaerobacterium在电极上的优先富集，结合相关菌株具有黄素基胞外电子传递（EET）和细胞色素c/氢化酶介导电极呼吸的证据，支持其与电极依赖性代谢的更强关联。因此，MEC中的电子传递可能源于功能多样化群落中多种机制的协同作用，而非单一主导途径。Alpha和Beta多样性分析证实了显著的群落重构，以及悬浮与电极附着群落间的分化。SEM分析证实了嗜热联合体能够在碳毡阳极上形成结构异质的生物膜。

研究结论翻译： 本研究表明，单室嗜热MEC能够在长期运行中维持从发酵甘蔗酒糟中产氢，同时支持电极附着微生物群落的发展。在所评估的连续运行条件下，反应器持续产氢132天，并在1.1 V时达到最高性能，H₂占气相组分的96%，最大面积归一化产氢速率为55.4 L H₂ m^?2 d^?1。由于施加电压是顺序增加的，最终阶段的性能提升反映了运行条件和微生物渐进适应的综合效应，而非单独归因于电压。微生物分析证实，嗜热MEC运行显著重塑了活性污泥接种物。群落演替涉及多样性初期降低并由Caldanaerobius主导，随后重组为以Moorella和Thermoanaerobacterium为主的最终联合体。悬浮与电极附着群落的分化，加上Thermoanaerobacterium在阳极上的优先富集以及SEM观察到的大量生物膜，证明了长期运行促进了独特的电极附着微生物生态位的建立。乙酸盐、乳酸盐和甲酸盐的同步变化进一步表明，产氢发生在一个涉及发酵、产乙酸转化以及潜在电极关联代谢的代谢互联联合体中。尽管16S rRNA基因测序无法直接将电化学或代谢功能归因于特定分类群，但综合的运行、微生物和微观证据表明，嗜热微生物选择和生物膜发育是实现从发酵酒糟中持续产氢的关键。这些发现支持了无膜嗜热MEC作为甘蔗酒糟生物电化学增值平台的可行性。