《Nucleic Acids Research》：CFDP1 is required for histone variant H2A.Z deposition by the human SRCAP chromatin remodeling complex
编辑推荐：
颅面发育蛋白1（CFDP1）是进化上保守的Bucentaur（BCNT）蛋白家族成员，为牙齿发育过程中细胞存活与分化所必需。其酵母同源物参与酵母SWR1C重塑复合物对组蛋白变体H2A.Z的沉积。CFDP1、H2A.Z沉积与哺乳动物SWR1同源物Snf2相关CR
颅面发育蛋白1（CFDP1）是进化上保守的Bucentaur（BCNT）蛋白家族成员，为牙齿发育过程中细胞存活与分化所必需。其酵母同源物参与酵母SWR1C重塑复合物对组蛋白变体H2A.Z的沉积。CFDP1、H2A.Z沉积与哺乳动物SWR1同源物Snf2相关CREBBP激活蛋白（SRCAP）之间的直接联系尚不清楚。本研究对人SRCAP复合物（SRCAP-C）进行了详细的生化重构与表征。研究发现CFDP1以盐浓度依赖的方式弱结合于SRCAP-C，且为SRCAP-C催化的H2A.Z二聚体交换所必需。CFDP1可刺激重构SRCAP-C的基础ATPase活性，提示CFDP1在调控内在催化ATPase活性中的必要性。此外，人诱导多能干细胞（hiPSCs）中CFDP1缺陷导致H2A.Z、H3K27me3和H3K4me3沉积在全基因组范围内减少，并伴随通常被这些修饰标记的发育基因上调。综上，研究结果揭示了CFDP1调控SRCAP-C沉积组蛋白变体H2A.Z的机制。鉴于SRCAP基因突变导致Floating-Harbor综合征——一种罕见的显性发育障碍，本研究为颅面发育与SRCAP介导的H2A.Z沉积之间提供了新的联系。
研究背景：颅面发育蛋白1（CFDP1）属于进化上保守的Bucentaur（BCNT）蛋白家族，最初被鉴定为牙齿发育过程中细胞存活与分化所必需的蛋白，并参与斑马鱼的颅面发育。酵母同源物Swc5是酵母SWR1C染色质重塑复合物的关键亚基，该复合物利用ATP水解能量催化组蛋白变体H2A.Z沉积入核小体。哺乳动物SWR1同源物为Snf2相关CREBBP激活蛋白（SRCAP），其作为SRCAP-C复合物的催化ATPase亚基。SRCAP基因突变导致Floating-Harbor综合征（FHS），一种以身材矮小、骨成熟延迟、语言发育迟缓和面部畸形为特征的罕见显性发育障碍。然而，CFDP1、H2A.Z沉积与SRCAP-C之间的直接联系尚不清楚，SRCAP-C催化H2A.Z沉积的分子机制也 largely 未知，主要受限于重构实验的不足。此前SRCAP-C的冷冻电镜重构复合物缺乏H2A.Z二聚体交换活性，提示缺失关键蛋白。因此，研究人员开展本研究以重构人SRCAP-C并解析CFDP1在其H2A.Z沉积活性中的作用。
关键技术方法：研究人员利用MultiBac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中共表达带Strep标签的人SRCAP与11种保守人蛋白（RUVBL1、RUVBL2、YL1、ARP6、ZNHIT1、BRD8、BAF53a、β-actin、DMAP1、GAS41和CFDP1），经Strep纯化和甘油梯度离心获得近均一的SRCAP-C；采用基于FRET的二聚体驱逐与沉积 assay 及凝胶基 assay 监测H2A.Z交换活性；采用MDCC-PBP荧光法测定ATPase活性；采用电泳迁移率变动分析（EMSA）检测核小体结合；采用siRNA介导的敲低结合CUT&RUN和RNA-Seq分析人诱导多能干细胞（hiPSCs，Penn0141-37-3株系）中H2A.Z及相关修饰的全基因组分布与基因表达。
研究结果：
CFDP1是SRCAP-C的H2A.Z二聚体交换活性所必需的：通过MultiBac系统重构SRCAP-C，定量质谱显示每个SRCAP含六拷贝RUVBL1/RUVBL2，与酵母SWR1C一致；CFDP1和BRD8在低盐（150 mM NaCl）下以亚化学计量水平弱结合，高盐（350 mM NaCl）下则检测不到，提示二者非稳定亚基。高盐纯化的SRCAP-C无二聚体交换活性，低盐纯化者活性微弱；加入重组CFDP1后，两种制备均表现出强烈的ATP依赖性二聚体交换活性，而CFDP1单独无活性。FRET二聚体沉积 assay 和凝胶基 assay 均证实SRCAP-C催化H2A.Z/H2B二聚体沉积并驱逐H2A/H2B二聚体。
SRCAP-C对几种组蛋白变体无底物偏好：FRET assay 显示SRCAP-C在含H3.1与含H3.3核小体之间的H2A.Z交换速率无显著差异；对H2A.Z.1与H2A.Z.2二聚体仅显示轻微偏好，表明SRCAP-C在这些变体间无强底物偏好。
CFDP1刺激SRCAP-C的基础ATPase活性：MDCC-PBP荧光法显示CFDP1以浓度依赖方式刺激SRCAP-C在无DNA或核小体底物时的基础ATPase活性（表观Kd >0.7 μM），CFDP1单独无荧光变化；含H2A核小体以浓度依赖方式刺激ATPase活性（Km约1.6 nM），游离H2A.Z/H2B二聚体进一步刺激之。EMSA显示CFDP1既不结合核小体也不影响SRCAP-C与核小体的结合，提示CFDP1通过相互作用影响催化活性。
CFDP1的BCNT结构域是SRCAP-C介导的二聚体交换所必需的：缺失酸性N端结构域（?69）对二聚体交换活性影响轻微；缺失BCNT结构域（?BCNT）则完全丧失二聚体交换活性；缺失对应无序区（?159）导致部分丧失。BCNT结构域缺失亦消除CFDP1刺激ATPase活性的能力，凸显BCNT结构域在哺乳动物复合物中的关键作用。
YL1和DMAP1亚基是SRCAP-C二聚体交换所必需的：从重构系统中逐一去除亚基显示，去除YL1或DMAP1导致二聚体交换活性完全丧失（去除YL1不影响复合物完整性，去除DMAP1则导致多个亚基丢失）；去除GAS41不破坏复合物完整性但导致活性部分丧失；去除BAF53a或BRD8不影响复合物完整性及二聚体交换活性，再次印证BRD8非稳定亚基。
CFDP1是人iPSCs中正确H2A.Z沉积所必需的：siRNA敲低CFDP1或SRCAP显著降低低盐（300 mM）和高盐（500 mM）缓冲液提取的染色质组分中H2A.Z水平，而总H2A.Z水平不变，表明CFDP1与SRCAP-C一样为H2A.Z的染色质掺入而非整体表达所必需。CUT&RUN结合SNAP-CUTANA spike-in归一化显示，siCFDP1细胞中H2A.Z围绕转录起始位点（TSSs）的特征性双峰富集明显减弱，H3K27me3和H3K4me3整体信号亦显著降低；BMP4、Brachyury及四个HOX簇等关键发育位点两种修饰均减少。25 949个TSS ±1 kb内的H2A.Z位点中11 334个（43.7%）在CFDP1敲低后显著变化；重叠H3K4me1和H3K27ac的活性增强子相关基因间H2A.Z位点受影响比例最高（833个中210个，25.2%），而对照为224 581个中10 475个（4.7%）。qRT-PCR显示CFDP1缺陷细胞中共富集H2A.Z与双价染色质标记的基因表达升高，低富集基因无显著变化。全基因组转录效应温和：48 h时SRCAP敲低仅改变157个基因，CFDP1敲低影响更少；157个基因中148个在CFDP1敲低时呈同向变化（Pearson r = 0.771；Spearman ρ = 0.695）。
讨论部分总结：H2A.Z高度保守并参与转录、DNA复制和修复，其上调与癌症和心肌肥厚相关；酵母SWR1C机制研究较清楚，但哺乳动物H2A.Z沉积调控尚待阐明。哺乳动物含Tip60/p400和SRCAP-C两种SWR1C相关重塑酶，二者均贡献H2A.Z沉积。此前CFDP1敲低研究提示其参与着丝粒异染色质区H2A.Z沉积，但CFDP1与SRCAP-C介导的H2A.Z交换的直接联系一直缺乏。本研究重构含CFDP1和11种重组蛋白的人SRCAP-C并证明其在CFDP1存在时具有强烈H2A.Z交换活性；亚复合物分析表明YL1、DMAP1和CFDP1对ATP依赖性H2A.Z沉积至关重要；CFDP1不影响核小体结合但为刺激基础ATPase活性所必需；iPSCs中CFDP1缺失导致H2A.Z全局减少。此前含10个亚基的重构SRCAP-C缺乏BRD8和CFDP1且无H2A.Z交换活性，而天然SRCAP-C质谱未检测到CFDP1肽段、免疫沉淀未检测到CFDP1与SRCAP ATPase互作，但全局质谱提示二者存在蛋白互作。本研究显示CFDP1弱结合SRCAP-C且 interaction 对盐敏感，低盐下亚化学计量结合并有可测活性，高盐下则二者均丧失；重新加入CFDP1后低盐再纯化未能共纯化，最可能的解释是CFDP1在体内为稳定亚基但纯化导致解离，或其在体内仅瞬时结合作为激活因子。CFDP1缺失不影响其他亚基结合，且CFDP1与SRCAP在多种人和小鼠组织中共表达。CFDP1在体内被广泛磷酸化和乙酰化修饰，提示其活性受多重调控；亦不能排除存在功能类似CFDP1的未知调控蛋白，因siSRCAP细胞总染色质H2A.Z水平低于siCFDP1细胞。酵母SWR1C-核小体初始冷冻电镜模型未观察到Swc5，而近期SWR1C-六体复合物模型可视化了Swc5的C端BCNT结构域，其与未缠绕DNA和组蛋白接触，提示Swc5稳定二聚体交换反应的中间核小体底物；该模型还显示BCNT结构域跨越Swr1 ATPase结构域，为ATPase刺激提供结构支持。本研究发现CFDP1的BCNT结构域同样为ATPase刺激和二聚体交换活性所必需，鉴于BCNT结构域的保守性，CFDP1的BCNT结构域可能也通过与SRCAP ATPase结构域互作、激活ATPase活性并稳定未缠绕的中间核小体底物来介导二聚体交换；AlphaFold预测的CFDP1 BCNT结构域二级结构与冷冻电镜解析的Swc5 BCNT结构域高度相似，包括与Swr1 ATPase结构域互作的保守氨基酸区域。一种可能机制是BCNT结构域与SRCAP ATPase结构域互作诱导构象变化促进活性构象。Park等人在本稿修订期间报道CFDP1是SRCAP-C的瞬时激活因子并展示含CFDP1的SRCAP-C冷冻电镜结构，CFDP1识别结合核小体的SRCAP-C并诱导促进核小体DNA解缠绕的构象变化，支持本研究结论。关于H2A.Z与H3.3共定位，本研究检验了SRCAP-C是否优先在含H3.3核小体上沉积H2A.Z，结果显示SRCAP-C对H3.1与H3.3无底物偏好，提示SRCAP-C向含H3.3核小体的招募可能是共定位的主要机制；与此一致，H3.3伴侣HIRA复合物与SRCAP-C互作，支持SRCAP-C通过HIRA复合物被招募至含H3.3核小体的模型。近期研究显示H2A.Z.2敲低和过表达分别模拟和挽救FHS表型，提示H2A.Z.2与FHS的功能联系；本研究表明SRCAP-C对H2A.Z.1与H2A.Z.2无显著底物偏好，SRCAP-C FHS突变体可能存在不同底物偏好，或存在与Tip60/p400及特定组蛋白伴侣协调的变体特异性沉积或去除机制。因此，SRCAP-C的生化和功能分析为理解SRCAP和组蛋白变体交换在发育与疾病中的作用提供了关键见解。
研究结论翻译：综上，研究结果揭示了CFDP1调控SRCAP-C沉积组蛋白变体H2A.Z的机制，并为颅面发育与SRCAP介导的H2A.Z沉积之间提供了新的联系。
