《ImmunoTargets and Therapy》：ANKRD22 Downregulation Reprograms Lipid Metabolism to Activate the Notch/Hes1 Pathway, Driving Immunosuppressive Macrophage Polarization in Colorectal Cancer
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背景：结直肠癌（CRC）中的巨噬细胞主要来源于单核细胞，然而肿瘤微环境（TME）调控其分化动态和表型定型的机制尚不明确。尽管研究人员此前已鉴定ANKRD22为巨噬细胞免疫调节因子，但TME对ANKRD22的调控及其对单核细胞-巨噬细胞分化的时序性影响仍不清楚。
背景：结直肠癌（CRC）中的巨噬细胞主要来源于单核细胞，然而肿瘤微环境（TME）调控其分化动态和表型定型的机制尚不明确。尽管研究人员此前已鉴定ANKRD22为巨噬细胞免疫调节因子，但TME对ANKRD22的调控及其对单核细胞-巨噬细胞分化的时序性影响仍不清楚。方法：研究人员采用非靶向代谢组学和细胞因子微阵列鉴定CRC细胞上清中抑制巨噬细胞ANKRD22表达的代谢物和细胞因子。通过飞行时间流式细胞术评估肿瘤免疫浸润。利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞ATAC测序（scATAC-seq）和多色免疫荧光染色研究ANKRD22下调对单核细胞向巨噬细胞分化的影响。结果：CRC细胞来源的代谢物和细胞因子通过p38 MAPK/MAX通路下调巨噬细胞中ANKRD22的表达。Ankrd22缺陷型巨噬细胞加速小鼠皮下肿瘤生长，促进免疫抑制性CD206?CD163?巨噬细胞亚群扩增并减少CD8?CD44?CD62L?效应T细胞数量。ANKRD22下调延迟巨噬细胞分化和成熟，同时增加单核细胞募集。机制上，ANKRD22抑制降低细胞内脂肪酸水平，进而激活Notch4/HES1通路，导致分化阻滞和免疫抑制性极化。该过程涉及TME中新鉴定的早期分化免疫抑制性CD9?CD127?巨噬细胞亚群。联合药理学抑制Notch和长效IL-7表达可逆转上述表型、减弱肿瘤生长并减少CD9?CD127?细胞群。结论：ANKRD22下调重编程脂肪酸代谢以激活Notch4/HES1通路，促进免疫抑制性巨噬细胞极化。ANKRD22是巨噬细胞可塑性的关键调控因子，也是重编程CRC免疫抑制性TME的有前景的治疗靶点。
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症相关死亡原因。肿瘤微环境（TME）作为CRC细胞生存的"土壤"，不仅调控CRC细胞的命运和表型可塑性，还影响治疗选择和疗效。巨噬细胞是浸润CRC TME的主要免疫细胞，连接固有免疫和适应性免疫，是建立免疫抑制性TME的关键。CRC中大多数肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）起源于外周血单核细胞，经转录因子如IRF8、STAT3和RBPJ调控分化为TAMs，但调控单核细胞浸润及分化为高度异质性巨噬细胞亚群的机制尚不完全清楚。研究人员此前鉴定含锚蛋白重复结构域蛋白22（ANKRD22）为TME响应蛋白，定位于巨噬细胞线粒体膜和脂滴，在经典激活的M1巨噬细胞中显著上调而在M2巨噬细胞中低表达。然而TME如何影响ANKRD22表达及CRC中巨噬细胞时序分化仍未知。本研究旨在揭示CRC细胞通过代谢物和细胞因子下调巨噬细胞ANKRD22表达，延迟巨噬细胞分化和成熟，从而放大TME免疫抑制的机制。
研究人员开展了以下研究：首先通过非靶向代谢组学和细胞因子微阵列鉴定CRC细胞上清中抑制ANKRD22表达的成分，利用RT-qPCR、Western blot、荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀（ChIP）揭示p38 MAPK/MAX通路调控ANKRD22的机制。通过CRISPR/Cas9构建Ankrd22?/?小鼠，将Ankrd22?/?或Ankrd22+/+巨噬细胞与CRC细胞共植入皮下建立肿瘤模型，利用飞行时间流式细胞术（CyTOF）和流式细胞术（FCM）分析免疫细胞浸润。通过scRNA-seq和scATAC-seq分析巨噬细胞分化轨迹和染色质可及性。利用空间转录组学分析人CRC组织中Notch通路激活情况。通过体外实验验证脂肪酸代谢对Notch通路的调控。最后通过联合Notch抑制剂和长效IL-7治疗评估治疗潜力。研究得出以下结论：CRC细胞来源的代谢物和细胞因子通过p38 MAPK/MAX通路下调巨噬细胞ANKRD22表达；ANKRD22缺陷型巨噬细胞通过CCL-受体相互作用和细胞外基质（ECM）重塑增强单核细胞募集并促进其免疫抑制性极化；ANKRD22下调通过LPL介导的脂滴水解受损降低细胞内脂肪酸水平，进而激活Notch4/HES1通路，导致巨噬细胞分化延迟和免疫抑制性极化；新鉴定的CD9?CD127?巨噬细胞亚群在TME中呈现免疫抑制表型；联合抑制Notch和靶向CD127可逆转上述表型并抑制肿瘤生长。本研究的重要意义在于揭示了CRC细胞通过免疫代谢轴阻碍巨噬细胞分化并促进免疫抑制表型的新机制，为CRC的TAM靶向治疗提供了潜在靶点和理论基础。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：非靶向代谢组学和细胞因子微阵列用于鉴定CRC细胞上清中的关键调控因子；CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Ankrd22?/?小鼠；飞行时间流式细胞术（CyTOF）用于高通量免疫细胞表型分析；单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq）用于解析巨噬细胞异质性和分化轨迹；空间转录组学用于人CRC组织中原位基因表达分析；多色免疫荧光染色（mIHC）用于组织中原位蛋白共表达验证。人CRC组织和配对癌旁正常组织来源于浙江大学医学院附属第二医院外科肿瘤科，外周血单核细胞来自健康供者。
结果部分：
CRC细胞通过多种旁分泌物质经p38 MAPK/MAX通路下调巨噬细胞ANKRD22表达：研究人员发现CRC组织来源CD14?巨噬细胞中ANKRD22表达显著低于癌旁正常组织。CRC细胞条件培养基、外泌体、代谢物和细胞因子均能下调巨噬细胞Ankrd22表达。非靶向代谢组学鉴定出10种在HCT116和MC38细胞上清中一致升高的代谢物，细胞因子微阵列鉴定出7种升高的细胞因子。验证实验表明N1-乙酰精胺（NAS）和25-羟基胆固醇（25-HC）以及CXCL1、CXCL5、CXCL10和CCL11显著下调ANKRD22表达。这些因子激活p38 MAPK通路并降低下游转录因子MAX表达，荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR证实MAX结合于ANKRD22启动子区域。
ANKRD22缺陷型巨噬细胞驱动CRC免疫抑制性TME形成：将Ankrd22?/?或Ankrd22+/+小鼠结直肠来源巨噬细胞（CDMs）与CT26细胞共植入皮下，Ankrd22?/?组肿瘤体积和重量显著增加，微血管密度和Ki-67?细胞数显著增加。CyTOF分析显示Ankrd22?/?组肿瘤中CD8?CD44?CD62L?效应T细胞比例降低，CD206?CD163?M2样巨噬细胞比例增加，FCM进一步证实CD206?巨噬细胞比例显著升高。
ANKRD22缺陷型巨噬细胞通过CCL-受体相互作用和ECM重塑增强单核细胞募集和分化：scRNA-seq分析肿瘤中CD45?CD11b?F4/80?细胞，通过Xist表达区分外源注射CDMs和募集而来的单核细胞来源巨噬细胞（MoMacs），发现Ankrd22?/?组肿瘤中募集的MoMacs显著增多。PKH-26标记实验证实Ankrd22?/?组巨噬细胞被募集MoMacs稀释程度更大。体外Transwell实验表明Ankrd22?/?巨噬细胞具有更强的单核细胞募集能力，阻断CCR1/2/5可部分抑制。CDM_Cluster 0在Ankrd22?/?组富集，呈现炎症抑制表型和M2样偏倚，GSEA显示肿瘤相关通路富集。MoMac_Cluster 1表现类似表型改变。Ankrd22?/? CDMs中Cxcl2、Ccl3、Cxcl1和Cxcl3水平显著升高，CCL-受体通路活性增强，ECM成分（FN1、SPP1、THBS）表达显著上调。
ANKRD22缺陷延迟肿瘤中单核细胞向巨噬细胞分化动力学：对小鼠肠道CD45?CD11b?F4/80?细胞进行scRNA-seq，CytoTRACE分析显示Clusters 1、4和10为祖细胞状态，Monocle 2拟时序分析证实Clusters 1和4处于早期分化阶段。Ro/e分析显示Ankrd22?/? CDMs中早期分化Cluster 1和4富集，FCM证实MHCII?CX3CR1?成熟巨噬细胞比例降低。肿瘤中CDMs和MoMacs的拟时序分析均显示Ankrd22?/?组早期分化亚群比例增加、终末阶段亚群比例降低。
Notch4/HES1通路参与ANKRD22抑制触发的巨噬细胞分化延迟和免疫抑制性极化：scATAC-seq分析Ankrd22?/?和Ankrd22+/+小鼠CDMs，差异峰分析提示转录因子Hes1可能与分化延迟相关。HES1结合位点活性分析显示Hes1转录活性在早期分化亚群中升高，pySCENIC分析证实Hes1活性在Ankrd22?/? CDMs中显著升高。Hes1、Jag1和Notch4在早期分化亚群中染色质可及性增加，提示Hes1经Jagged1-Notch4轴激活。GSEA显示Notch通路在Ankrd22?/?肿瘤MoMacs中富集，Jag1和Notch4在免疫抑制性早期分化Cluster 1中表达升高，而Notch1/2/3无变化。人CRC空间转录组证实肿瘤相关CD68?巨噬细胞中Notch通路激活且HES1和JAG1转录显著上调。体外实验表明重组Jagged1（rhJagged1）激活Notch通路可阻碍单核细胞向巨噬细胞分化（FOS水平持续维持）并增加免疫抑制性ARG1表达。
细胞内脂肪酸减少介导ANKRD22缺陷诱导的巨噬细胞Notch激活：Ankrd22?/?巨噬细胞脂滴积累显著增加，但细胞内游离脂肪酸水平显著降低，ANKRD22过表达则增加细胞内脂肪酸水平。Ankrd22?/?巨噬细胞中Lpl表达下调和LPL酶活性降低。外源性油酸补充下调HES1和Jagged1表达，而抑制脂肪酸合成则上调两者表达。PPAR激动剂抑制Jagged1和HES1表达，拮抗剂则增加其表达，且激动剂可阻断脂肪酸合成抑制诱导的Jagged1/HES1上调。结果表明ANKRD22缺陷通过LPL损害脂滴释放脂肪酸，降低细胞内脂肪酸水平，触发Notch通路激活。
分化延迟和Notch激活驱动肿瘤中免疫抑制性CD9?CD127?亚群：研究人员鉴定出F4/80?CD9?CD127?巨噬细胞亚群，在Ankrd22?/?小鼠正常结直肠和皮下肿瘤中比例显著升高，在人CRC组织中丰度高于癌旁正常组织。该亚群在肿瘤中免疫抑制基因（Arg1、Spp1、Mmps）上调，FCM和mIHC证实人和小鼠肿瘤来源的CD9?CD127?亚群中ARG1和SPP1表达升高，而正常结直肠中对应亚群表达极低。该亚群主要定位于癌与非癌区域交界处。Notch抑制剂Limantrafin（CB-103）显著降低F4/80?CD9?CD127?亚群比例，抑制脂肪酸合成则增加该亚群。小鼠肿瘤模型中联合给予Notch抑制剂和长效IL-7（Efineptakin Alfa）显著抑制肿瘤生长并减少F4/80?CD9?CD127?亚群比例。
讨论部分总结：本研究揭示了CRC细胞通过释放代谢物和细胞因子抑制巨噬细胞ANKRD22表达，延迟巨噬细胞分化和成熟，延迟的巨噬细胞亚群通过募集单核细胞并将其极化为TAMs来促进和放大免疫抑制性TME。研究人员发现CRC来源代谢物和细胞因子通过p38通路下调ANKRD22，巨噬细胞中p38激活刺激下游MAD家族分子拮抗核心因子MAX的转录活性。CyTOF分析显示Ankrd22?/?巨噬细胞与肿瘤细胞混合后CD206?巨噬细胞比例显著增加、记忆效应CD8?T细胞减少。Ankrd22?/?巨噬细胞募集外周血单核细胞并促进其获得免疫抑制表型，scRNA-seq显示CCL配体-受体通路显著激活，阻断CCR1/2/5仅部分抑制募集能力。分化延迟的TAMs促进和放大免疫抑制微环境。scATAC-seq揭示Hes1在延迟分化亚群中染色质可及性和转录活性增加，持续的Hes1表达维持ANKRD22缺陷型巨噬细胞的早期分化状态。JAG1-NOTCH4而非NOTCH1/2/3在肿瘤巨噬细胞中上调，联合抑制Notch和CD127特异性配体IL-7效果显著增强。ANKRD22抑制增加脂滴水平但降低细胞内脂肪酸水平，可能与脂滴水解受损有关，LPL可水解甘油三酯释放游离脂肪酸。脂肪酸是PPARs的主要配体，调节PPAR活性可逆转脂肪酸水平改变对Notch通路的影响。本研究局限性包括：脂代谢重编程激活Notch通路的具体机制尚不清楚；单细胞数据来自混合样本可能掩盖个体间异质性；该巨噬细胞亚群对TME的广泛影响及与其他免疫细胞的相互作用有待进一步探索。研究结论翻译：ANKRD22下调重编程脂肪酸代谢以激活Notch4/HES1通路，从而促进免疫抑制性巨噬细胞极化。ANKRD22是巨噬细胞可塑性的关键调控因子，也是重编程CRC免疫抑制性TME的有前景的治疗靶点。
