物候期对Tithonia diversifolia（Hemsl.）A. Gray乙酸乙酯提取物体外抗Haemonchus contortus卵孵化活性的影响及其植物化学成分特征

《Parasitologia》：Influence of Phenological Stage on the Phytochemical Composition and In Vitro Ovicidal Activity of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray Ethyl Acetate Extracts Against Haemonchus contortus

　　

Haemonchus contortus是一种致病性胃肠道线虫，可损害反刍动物的生产性能，其防控因广泛的驱虫药耐药性而受阻。Tithonia diversifolia已被提出作为一种富含植物次生代谢物（PSMs）的可持续饲草来源。本研究评估了T. diversifolia水醇提取物（HAE）在三个物候期（再生28、42和56天）的体外卵孵化抑制活性及植物化学成分特征。叶片材料采集自墨西哥韦拉克鲁斯州Tlapacoyan，经超声辅助和浸渍法提取，随后通过液–液分配获得乙酸乙酯部位（EtOAc–F）和水相部位（Aq–F），所得样品采用HPLC-PDA进行表征。采用虫卵孵化试验测定对H. contortus的半数抑制浓度（IC50）值。水醇提取物表现出显著的卵孵化抑制活性，28 d、42 d和56 d刈割样品的IC50值分别为6.23、10.40和4.02 mg mL^?1。经分配后，Aq–F完全丧失生物活性，而EtOAc–F表现出明显的活性富集，IC50值分别降至0.66、0.64和0.51 mg mL^?1。色谱分析表明，乙酸乙酯部位保留了羟基肉桂酸类、酚类化合物和木脂素类。尽管42天阶段表现出最大的植物化学复杂性，但56天阶段显示出最高的卵孵化抑制活性。该模式提示，对于T. diversifolia EtOAc–F，生物活性与特定酚类化合物和木脂素类的相对丰度及身份关系更为密切，而非仅取决于植物化学复杂性。这些发现支持T. diversifolia提取物的未来标准化，并有助于确定后续体内评估的最佳采收窗口，以纳入综合寄生虫管理框架。

研究背景方面，胃肠道线虫（GIN）感染是热带放牧系统中制约反刍动物生产性能的主要因素之一，其中Haemonchus contortus是危害小反刍动物和放牧牛健康、福利及生产性能的最具致病性线虫之一。驱虫药耐药性（AR）的广泛出现削弱了现有化学防控策略的有效性，因此将富含植物次生代谢物（PSMs）的植物或生物活性植物提取物纳入综合寄生虫管理方案已成为有前景的替代路径。Tithonia diversifolia（墨西哥向日葵）为菊科（Asteraceae）速生灌木，富含具有民族药理学和生物学活性的PSMs，其叶粉和提取物对H. contortus已报道具有直接驱虫活性，生物导向分离在活性乙酸乙酯部位中鉴定出香豆素类、香豆酸酯类、羟基苯甲酸类和羟基肉桂酸类。然而，植物组织内PSMs的合成与浓度随季节、胁迫因素和物候期动态变化，关于T. diversifolia在不同成熟阶段对GIN驱虫活性的研究有限。因此本研究旨在评估三个物候期（28、42和56天）T. diversifolia水醇提取物（HAEs）及其乙酸乙酯部位（EtOAc–F）和水相部位（Aq–F）对H. contortus虫卵孵化的体外抑制活性，同时表征其植物化学成分以识别关键生物活性标志物。

研究人员开展了以下研究：采集Tlapacoyan（韦拉克鲁斯州）实验区T. diversifolia新鲜叶片，按标准化刈割后三个再生阶段（28 d早期营养期、42 d晚期营养期/最佳产量窗口、56 d早期生殖/预花期）取样，经干燥、研磨后以甲醇:水（30:70 v/v）超声辅助提取结合浸渍法获得HAEs，再经液–液分配获得EtOAc–F和Aq–F，采用HPLC-PDA表征，并以虫卵孵化试验（EHA）测定IC50。结论为：T. diversifolia提取物具有显著体外卵孵化抑制活性，乙酸乙酯分配在各物候期均大幅提升效力；56天早期生殖阶段活性最高，42天阶段植物化学复杂性最大；卵孵化抑制效力主要由特定生物活性成分的相对丰度而非总体植物化学复杂性决定。其重要意义在于为T. diversifolia提取物的标准化及确定最佳采收窗口提供依据，支持后续体内研究和综合寄生虫管理框架的应用。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员从墨西哥韦拉克鲁斯州Tlapacoyan的CEIEGT-FMVZ-UNAM实验区采集T. diversifolia叶片（样本队列来源明确），按28、42和56天再生阶段取样；采用超声辅助（40 kHz）结合室温浸渍的水醇提取，经液–液分配获得EtOAc–F与Aq–F；采用HPLC-PDA（Supelcosil LC–F反相柱，水/0.5%三氟乙酸–乙腈梯度）进行植物化学成分表征并以峰高计算相对丰度；以实验感染单特异性H. contortus分离株（INIFAP–HcIVMr–SAI）的供体羔羊回收虫卵，在96孔板进行虫卵孵化试验，经四参数逻辑非线性回归计算IC50及95%置信区间（CIs）。

研究结果方面：3.1 T. diversifolia水醇提取物（HAEs）跨物候期的驱虫活性——通过EHA测定发现，HAEs在各物候期均呈剂量依赖性抑制虫卵孵化，20 mg mL^?1时28、42和56天提取物抑制率分别达99.78%、99.72%和100%，与阳性对照相当；56天提取物IC50最低（4.02 mg mL^?1），28天次之（6.23 mg mL^?1），42天最高（10.40 mg mL^?1）。3.2 T. diversifolia HAE分级与卵孵化效力优化——通过液–液分配发现，卵孵化抑制活性集中于EtOAc–F，Aq–F在所有测试浓度完全丧失活性（孵化率93.66 ± 0.51%，与阴性对照相似）；EtOAc–F在低至2 mg mL^?1时仍保持强效（28、42和56天分别为97.97%、93.46%和100%），IC50降至0.66、0.64和0.51 mg mL^?1，分别较粗提物降低9.44、16.25和7.88倍；56天EtOAc–F效力最高，28天与42天置信区间重叠。3.3 三个物候期T. diversifolia部位（EtOAc–F和Aq–F）的植物化学成分谱——通过HPLC-PDA分析发现，EtOAc–F含有更广泛的酚类化合物（羟基苯甲酸、原儿茶酸、绿原酸和对香豆酸）及木脂素类，Aq–F化学成分较简单，主要为水杨苷、香豆酸酯类和极性酚类；56天阶段多个酚类化合物和木脂素峰高最大，酚酸峰（Rt = 10.192 min）从28天至56天总体增加1.41倍，木脂素峰（Rt = 10.55 min）在28至56天总体增加1.01倍（28至42天下降2.1倍，56天增加2.12倍）；对香豆酸（Rt = 8.93 min）和一个未鉴定化合物（Rt = 10.88 min）仅在42天EtOAc–F中检出；42天EtOAc–F植物化学复杂性最大，水杨苷和香豆酸酯为Aq–F主要标志物，水杨苷在水相基质中至56天保持稳定；28天幼嫩叶片缺乏酸性特化分子。

讨论部分总结：研究人员将某些植物生物活性增强归因于化合物丰富度与协同相互作用而非单一成分。本研究中42天和56天刈割样品色谱轮廓较28天更复杂，随时间推移色谱图显示向特化次生代谢物渐进转变，42天总体化学多样性最大；28天早期营养期仅见中等基线浓度的羟基苯甲酸类、酚酸类和木脂素类，香豆酸酯为主要前体信号（相对丰度24.68%），随植株老化其优势减弱。42天虽集中最广泛的酚类成分但卵孵化效力并非最高，56天早期生殖阶段体外活性最强，与木脂素（14.18%）和酚酸类特定稳定信号相对浓度增加相吻合，提示体外卵孵化效力可能由特定活性化合物类的相对丰度而非总体植物化学多样性决定。分级后效力提升提示粗提基质中非活性或低活性成分可能稀释或掩盖活性。木脂素类、肉桂酸衍生物和酚类化合物可能是56天乙酸乙酯部位卵孵化活性的主要贡献者；木脂素类参与植物防御，计算机模拟提示木脂素可干扰寄生线虫脂质代谢关键酶磷酸甲基转移酶（PMT-1），破坏膜生物合成、损伤幼虫角质层并损害虫卵活力和孵化率；原儿茶酸和肉桂酸衍生物等酚酸类可破坏虫卵壳基质外层，其低分子量有利于被动扩散，分子对接显示肉桂酸和原儿茶酸衍生物对线虫β-微管蛋白具有强结合亲和力。水相与乙酸乙酯部位的主要差异在于基本化学分配：Aq–F保留水杨苷和香豆酸酯等极性成分，但缺乏EtOAc–F保留的特化木脂素类、肉桂酸衍生物及疏水性酚类和有机酸，因此选择性乙酸乙酯分级显著增强卵孵化效力（最具活性阶段IC50从4.02降至0.51 mg mL^?1，降低7.88倍）。基于56天粗提物IC50的概念性验证计算表明，所需生物活性PSM水平落在现实自愿采食范围内，支持未来体内试验的价值。研究人员建议T. diversifolia提取物标准化应以总木脂素类、肉桂酸衍生物和酚类化合物为关键植物化学指标和主要生物活性标志物；战略性的农艺 timing 对安排采收或建立药用林牧放牧地至关重要，28天过早采收较56天HAE体外卵孵化活性低35.5%；综合营养值与驱虫活性，42至56天再生间隔是未来体内评估最有前景的采收窗口。

研究结论部分翻译：Tithonia diversifolia提取物对Haemonchus contortus表现出显著的体外卵孵化抑制活性，乙酸乙酯分配在所有测试物候期均大幅增强效力。早期生殖56天阶段驱虫活性最高，而42天阶段植物化学复杂性最大。这表明卵孵化效力在很大程度上由特定生物活性成分的相对丰度决定，而非仅取决于总体植物化学复杂性。综上所述，这些发现为进一步开展化合物层面和体内研究提供了依据，以支持生物活性T. diversifolia提取物的标准化，并为综合寄生虫管理框架确定最佳采收窗口。