《Biophysica》：Effects of Microampere-Scale Wireless Conductive Microelectrostimulation on the Growth of Aspergillus fumigatus in Single-Dish Electroculturomics Setup
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暴露于电设施（包括电场和电流）会影响微生物生长。对物种、基质和特定设置的系统研究定义了电培养组学（electroculturomics）。在此背景下，微电流对兼性微生物病原体的影响仍存在争议，因此限制了此类设施的广泛临床使用。本研究呈现了一个低重复体外系统的初
暴露于电设施（包括电场和电流）会影响微生物生长。对物种、基质和特定设置的系统研究定义了电培养组学（electroculturomics）。在此背景下，微电流对兼性微生物病原体的影响仍存在争议，因此限制了此类设施的广泛临床使用。本研究呈现了一个低重复体外系统的初步观察结果。将普遍存在的霉菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）在沙氏葡萄糖琼脂（Sabouraud Glucose Agar）固体培养上反复接受一种市售设备的处理，该设备通过将带负电荷的空气颗粒喷洒到改良培养皿中的固体培养物上，以3.5 μA（微安）微电流进行无线传导微电刺激（WCMES）。与标准培养相比，处理后的培养物显示出增加的侧向生长，表现为菌丝质地视觉上明显的差异；菌丝的径向生长速率保持不变。增加的生长与处理持续时间呈正相关。同时，由于处理，次级发育（培养皿内新的菌丝位点）显著增加，可能归因于喷洒效应产生的微气流使真菌孢子发生位移。这些结果在无技术或生物学重复的情况下获得，暗示了有无处理条件下菌丝生长的复杂动力学，因为菌丝垫的折叠被规律性观察到。真菌对电刺激的响应可能转化为生物技术和生物修复应用的前景，但也可能暗示生物医学并发症，涉及菌丝真菌的感染动力学及其在体内接受此类电刺激处理时对免疫应答和治疗处理的原位耐药性。
**研究背景**：电设施（包括电场和电流）对微生物生长的影响已有报道，但对物种、基质和特定设置的系统研究——即电培养组学（electroculturomics）——仍处于起步阶段。无线传导微电刺激（WCMES）出现于2010年代初期，其原理是将大气气体电离后喷洒到目标表面，通过可调中性电极闭合电路。然而，微电流对兼性微生物病原体的影响仍存在争议，这限制了此类设施在临床中的广泛应用。烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种真核、多细胞、兼性致病霉菌，地理分布极广且在疾病环境中高度流行，是研究具有生物技术、环境和生物医学影响的复杂生命形式的合适模型。本研究作为初步研究，旨在：（1）检验微安级等效电流是否对真菌生长产生可观察效应；（2）建立导电培养皿及整个实验装置对WCMES实验的适用性；（3）确定嵌入琼脂底部的铝箔本身对真菌生长的影响；（4）在有限暴露参数范围内记录初步结果以确定未来基础研究方向；（5）根据结果在相关文献中识别并讨论医学和生物技术应用的前景与禁忌。
**研究方法**：研究人员使用两株烟曲霉临床菌株（HCPF-8165和HCPF-14960，来源于希腊雅典大学致病真菌保藏中心HCPF/UoA），在添加0.5% w/v氯霉素的沙氏葡萄糖2%琼脂（SGA）上培养。导电培养皿通过在浇注培养基前嵌入单独高压灭菌的铝箔条制备，铝箔边缘折叠越过培养皿唇部并折向皿底，培养皿置于金属板上，金属板与铝箔折叠部分接触并收集喷洒在皿周外的离子流，从而增加电荷返回设备的效率。整个装置置于膨胀聚苯乙烯绝缘材料上。WCMES处理使用Wetling W200氧气离子化设备（Wetling EU ApS，丹麦），输出电流强度可调范围为0.5–4 μA，本研究选择3.5 μA（次高设置）进行处理。重复处理实验：三只导电培养皿分别接受1、10和60分钟处理，每日进行，培养皿在室温（RT）下培养，每日测量菌丝直径/半径并计数次级菌丝形成位点（MFL）。铝箔对照实验：HCPF-14960菌株接种于含铝箔培养皿和标准培养皿各一只，不进行WCMES处理，室温培养，评估铝箔本身对真菌生长的影响。单剂量预备实验：HCPF-8165菌株接种于一只标准培养皿和三只导电培养皿，后者分别在接种后接受1分钟、10分钟和1小时的单次处理，标准皿开放71分钟以模拟暴露条件。所有开放空气暴露过程均在层流空气流柜（KE12，ELMED，雅典，希腊）中进行，培养皿用弹性膜密封后置于柜中室温培养。
**研究结果**：
**铝箔对菌丝生长的净效应**：未处理导电培养皿（含铝箔，Al+）中HCPF-14960的生长明显少于标准培养皿（Al?），第一天直径分别为0.4 cm和0.6 cm，第二天分别为2.4 cm和2.8 cm。7天后，导电皿中菌丝垫稀薄，而标准皿中菌丝垫致密并呈现径向折叠。这表明嵌入固体培养基中的铝箔条对真菌生长产生明显不利影响，第一天菌丝直径减少33.3%，第二天减少约14.3%。
**单剂量WCMES处理对次级生长和污染的影响**：单剂量WCMES处理（HCPF-8165）与未处理标准皿比较，1小时处理组菌丝生长快于标准组；1分钟处理组完全未能生长，可能由于WCMES诱导效应过低 combined with 铝箔存在的不利效应；10分钟处理组按菌丝直径（2r）计算单位时间生长明显少于未处理标准组。所有三只反复处理培养皿（HCPF-14960）在实验期间菌丝径向生长速率相似但不完全相同。结果提示反复处理菌丝的径向扩展主要表现为动力学（kinetic）而非动态（dynamic）差异。处理 sessions 在观察第4天后被迫停止，因为次级自体性和异体性菌丝变得过于丰富，明显干扰初级菌丝生长测量。60分钟处理组的菌丝计数比10分钟组高212.5%，比1分钟组高566.7%；10分钟和60分钟处理组的菌丝计数分别比标准组高100%和425%。最引人注目的观察是菌丝质地的明显差异：未处理菌丝编织稀疏、菌丝稀少，而反复60分钟处理的菌丝厚实致密；1分钟和10分钟处理组密度明显较低。所有处理培养皿的初级菌丝均出现折叠，折叠深度与处理时间相关；未处理的稀疏菌丝未出现任何折叠。所有菌丝在观察时具有相同的表观直径，但非径向折叠意味着真实直径增加。
**讨论部分总结**：研究人员指出，嵌入铝箔条的不利效应清晰表明，WCMES处理皿中观察到的生长增加（径向或更可能是侧向）必须归因于WCMES本身，其正向效应克服了铝箔存在的负向效应。单次处理培养皿的比较结果可由两个因素解释：一是新鲜空气可利用性的差异（10分钟样品开放10分钟而标准皿开放71分钟）；二是铝箔条对菌丝生长的负向效应。1分钟和10分钟WCMES处理明显不足以使诱导效应克服不利效应，低暴露时间产生的累积剂量过低，无法克服铝箔存在的抑制/有害效应，这创造了一个WCMES暴露阈值，需要诱导菌株克服该阈值才能使诱导效应可观察。60分钟诱导足以克服铝箔的不利影响，相应菌丝生长超过标准组。累积剂量提供了对菌丝施加的比较诱导的概念。在重复处理培养皿中，多次处理 session 的聚合性质预期即使对于较短时间暴露的培养皿也能产生可观的累积剂量，因此观察到增加的诱导效应。关于应用前景，研究人员讨论了微生物生长的操纵可能导向废物处理和分解、生物量和次级代谢产物生产、同种异体体内表达等新方法。电刺激（ES）治疗在检测或怀疑活动性微生物感染时应被视为有条件禁忌。WCMES对微生物生长是正向还是负向效应的可靠答案对生物技术应用至关重要。最重要的内涵不在于前瞻性应用领域，而在于径向生长的动力学而非动态差异可能影响宿主免疫应答。 conceivable mechanism 可能由于较快 compared to 较慢的初始径向生长速度及因此的播散潜力，或由于较快 compared to 较慢的出现和暴露应答诱发抗原标记。最重要的 issue 是优先侧向而非径向生长的可能性。在呼吸道或其他侵袭性感染背景下，紧密编织、致密、缓慢推进的菌丝与侵袭性扩展但结构稀疏的菌丝之间的区别可能具有重要临床意义。菌丝状态本身通过结构连续性保护真菌细胞免受吞噬作用。生物膜形式的真菌在侵袭性曲霉病中常规遇到且高度耐药，其与WCMES引起的增强生长之间可能的正相关可能暗示WCMES与耐药性之间的正相关确实有效。曲霉球可能是另一个好例子。关于WCMES与定植，污染和次级菌丝发育在视觉评估中清晰可见，应更多归因于处理条件而非被动暴露。总菌落形成单位和菌丝形成单位（CFU-MFUs）数量的增加可能由于W200设备喷洒离子产生的气流有利于真菌分生孢子和空气传播颗粒的被动飞行。气流单独足以解释时间/MFU计数的不成比例性，使设备电动力学效应的任何暗示在此效应中不必要。真正的次级菌丝（定义为与初级菌丝空间分离生长的新菌丝，起源于MFUs）的产生是总生物量增加中非常重要的因素。关于WCMES与菌丝动力学，反复/每日处理菌丝的质地与相应标准组相比清晰表明增强的生长以侧向而非轴向方式实现，导致相邻菌丝相互推挤、融合和推动，从而产生3D发育的框架。关于WCMES与菌丝动力学，菌丝生长模式涉及菌丝分支，在非环境触发的探索模式下，由于真菌需要优化利用生物量以开发给定基质区域，有利于侧向而非轴向生长。尖端分支（分裂尖端分支）倾向于有利于延伸而非扩展，以增加菌丝的 area coverage 并平衡尽可能远探索和尽可能广泛充分利用资源的双重任务。这种双重功能最好由圆形扩展模式服务。关于WCMES在酵母中的视角，酵母出芽实际上是一个受较少限制的分支过程。关于WCMES在真菌生理学背景下的讨论，电刺激已被发现增加人类细胞中ECM产生如弹性蛋白和胶原蛋白，从而通过增强损伤区域再增殖和修复提高愈合率。电负性在此背景下似乎特别有益。如果WCMES像对人类细胞那样增加真菌菌丝中的细胞代谢，囊泡循环和产生的速度将超过菌丝延伸的速度。关于研究局限性和未来研究，本研究为初步、预备性质，选择了扩展而非广泛的方法。视觉指示被用作增加生长（侧向和径向）的提示，未进一步进行图像分析或代谢指标分析。WCMES处理设置过于粗糙和近似，无法从高信息量和准确的方法中在方法学上受益。W200设计用于特定应用，不需要相对于受试者的准确距离和角度定位。因此，实验装置本质上过于不准确，无法进一步添加技术甚至生物学重复。统计学的 inclusion 将是错误的且 definitely counterproductive。WCMES处理的生物学效应确认了其存在和时间依赖性。气流 of this particular instrument spraying ions 仍构成WCMES效应；气流不能与离子产生和喷洒解耦。如果类似实验获得势头，可考虑使用更小的5 mm培养皿同时暴露 duplicates。本研究选择最大处理强度（减去一次迭代以确保技术安全）以最大化可观察效应的可能性。同样，应用1小时处理。为防范爆炸性生长及因此早期无法测量和表征的可能性，也使用了10分钟和1分钟迭代。缺乏许多不同的假处理实验是此设置中的有意选择。标准组（严格来说不是假处理）是实验设置限制内最相关和稳健的选择。关于连续处理 session 之间的方法学一致性和可重复性，这些固有地受到损害。生物成分电阻存在不可避免的改变，使得处理 session 的精确复制不可能。导电培养皿本身是促进电流流动方面的不确定性来源。许多测量可能使用正确设备进行以证明导电性并将实际强度值与仪器设置关联，这 presupposes 存在能够在3.5 μA或更低范围内可靠敏感测量的仪器，但未 pursued or explored。
**结论翻译**：WCMES处理，当为重复性质时，对烟曲霉固体培养产生稳定的诱导效应，从而提示正的时间/处理依赖性。这证明了处理方案的功能性：不一定是所路由电流的功能性，而是整合WCMES程序的功能性。这表明处理设置的功能性并解决了第1节中提出的目标（1）和（2）。这种稳定的诱导效应，如本文所呈现并附所有适用局限性，与mA级传导ES形成对比，后者的诱导或抑制结果被证明对细菌和真菌均高度条件性。嵌入生长培养基中未经WCMES暴露的铝箔条明显具有抑制作用，从而解决了目标（3），并提示对于正向诱导结果，解释和评估时需谨慎，不是在定性方面而是在定量值方面。然而，如果观察到负向抑制结果，应谨慎考虑，因为这些可能部分或完全归因于铝箔的存在。关于未来研究领域（目标（4）），菌丝如果在空间、生物学和生态学上不受挑战，使用径向和侧向生长的组合来充分利用空间和资源。本文将折叠的存在视为径向和侧向生长的不匹配，如果得到进化支持，可能产生菌丝的穹顶状发育，因此是特定条件下WCMES处理增强生长的有效指标。在这些条件下，径向扩展变化不大。相反，处理培养皿显示质地的定性差异并发展出更多次级位点。这种诱导可能影响治疗应用，特别是当WCMES用于治疗其他非感染性病理时。有证据表明原位WCMES处理实际上减少微生物负荷，可能通过诱导局部免疫应答，或由于对采样和计数微生物的抑制效应，或两者兼有。然而，鉴于其对烟曲霉的体外效应是诱导性的且烟曲霉未被包含/鉴定在上述研究中被WCMES抑制的局部微生物组内，应记住这种特定真菌——可能其他真菌（特别是霉菌）以及 conceivably 其他微生物群——可能在接受WCMES的生物隔室中被扩增。因此，这种可能性必须与预期益处和适用预防和/或受试者实际免疫状态相权衡。另一方面，这种诱导的生物技术转化可能对生产性或还原性应用有前景。未来，基础研究可能进一步分析这些发现并解决因果因素和机制复杂性。需要多样化的、技术重复的假处理对照研究。最后，关于目标（5），所引用文献暗示菌丝垫的折叠，即使在开放皿被动空气采样产生的单MFU菌丝中，也给出不成比例的侧向和轴向生长速率。由于分裂尖端分支倾向于维持菌丝的角密度，并在必要时由融合事件和分支率变化支持，折叠意味着空间上不成比例的安排， conceivably 是侧向扩展事件被吸收到三维安排中。这种安排可能是临时的和非对称的，或非常繁琐和对称的。后者意味着更平滑和更均匀的事件 succession 和 climax。这种径向和对称折叠形成环的较远边缘可能表示在主要或简单强烈侧向生长阶段之后向优先顶端/轴向生长和分支的过渡。或可能存在菌丝生长比率不同阶段之间的过渡，最可能从指数到过渡到线性。连续的折叠环可能意味着这种过渡现象的重复，持续时间也许可通过折叠的径向长度推断。这种增量生长，在此被视为ES的效应但在无ES处理时也观察到，可能对阐明和理解菌丝真菌的感染动力学有影响，并在长期内可能允许一些创新治疗选择。
