最长100个单元的DNA模拟螺旋折叠体：基于二聚大分子单体的固相合成策略及多蛋白复合物识别

《Nucleic Acids Research》：DNA mimic helical foldamers with up to 100 units: synthesis and recognition of a multiprotein complex

　　

摘要翻译

DNA模拟折叠体（DNA mimic foldamers, DMFOs）是呈螺旋折叠的芳香寡酰胺，其形状与电荷分布模拟双链B型DNA。DMFO由两种氨基酸单体M和Q交替构成。研究人员介绍了一种在固相上合成(MQ)_n寡聚物的新方法，从而生产出长达100个单元的序列，在形式上相当于50个碱基对（base pair, bp）的DNA双链体。该方法以二聚Fmoc-MQ-OH作为构建块。利用携带不同侧链的Q与M单元合成了三种此类大分子单体，并在所有系列中验证了固相合成方案。研究表明，螺旋手性由序列中的单个手性残基决定。纯化后的长寡聚物通过反向高效液相色谱（reversed phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC）、质谱（mass spectrometry, MS）、圆二色谱（circular dichroism, CD）和核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance, NMR）分析其纯度、身份及螺旋手性偏向。在Ca²⁺存在下形成的折叠体团簇可通过低温电子显微镜（cryogenic electron microscopy, cryo-EM）直接观察。最后，研究人员证明一个72单元长的DMFO与染色质重塑复合物INO80的A模块（A-module）结合，其亲和力略强于一段可比的DNA双链体。该复合物在3.59 ?分辨率下的cryo-EM结构显示，DMFO占据A模块的DNA结合区域。

论文解读

一、研究背景

芳香寡酰胺折叠体（aromatic oligoamide foldamers, AOFs，指由芳香寡酰胺主链构成的、具有稳定可预测构象的合成折叠分子）已在5–10 kDa分子量范围内常规制备。其抗蛋白酶与核酸酶降解、可携带天然蛋白质氨基酸不具备的多样侧链，且构象由主链成分决定、基本不受侧链组成影响，因而成为识别蛋白质大面积表面、干扰蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interactions）及蛋白质-核酸相互作用（protein–nucleic acid interactions, PNIs）的理想骨架。其中，Q（8-氨基-2-喹啉羧酸）与M（8-氨甲基-2-喹啉羧酸，含额外亚甲基的Q类似物）交替形成的(MQ)_n单螺旋，可在直径、螺旋角度及大沟/小沟等整体形状上再现B型DNA双链；若M与Q再携带负电荷侧链，则构成DNA模拟折叠体（DNA mimic foldamers, DMFOs），能在拓扑异构酶1、HIV整合酶等PNIs中与DNA本身竞争结合蛋白质。然而，此前DMFOs最长仅相当于16 bp DNA双链（n=16），不足以靶向由多结构域、多亚基蛋白复合体执行的、涉及更大PNI界面的过程，例如DNA绕组蛋白八聚体的包装、染色质重塑以及围绕核糖体的翻译过程。因此，将DMFOs拓展至更长序列以识别多蛋白复合体成为重要的研究动机，但当时固相合成报道的折叠体尚不足40个单元，构成长序列合成的瓶颈，这即是本研究拟解决的关键问题。

二、主要研究方法

本研究的蛋白质样品来源于嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）的染色质重塑复合物INO80，其亚基通过MultiBac多体系统在昆虫细胞（High Five细胞）中表达，经抗FLAG亲和色谱与阴离子交换色谱纯化，获得INO80 A模块（INO80^A-module）及含A、C模块的N端截短型INO80ΔN。合成方面的关键方法为以二聚Fmoc-MQ-OH大分子单体的自动化固相折叠体合成（solid phase foldamer synthesis, SPFS）。表征手段包括反向高效液相色谱（reversed phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC）、质谱（mass spectrometry, MS）、圆二色谱（circular dichroism, CD）、核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance, NMR）及动态光散射（dynamic light scattering, DLS）。结合定量评估采用生物层干涉技术（bio-layer interferometry, BLI）与电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assays, EMSA）。结构解析采用低温电子显微镜（cryogenic electron microscopy, cryo-EM）。

三、研究结果

（一）二聚构建块作为大分子单体。研究人员设计并合成了携带Q₄Pho、Q₅Pho聚膦酸酯侧链及羧酸根侧链的三种二聚Fmoc-MQ-OH构建块。该策略将偶联步骤减半，使偶联在反应活性更高的M苄胺上进行，从而避免对Q芳香胺进行酸氯化活化；同时偶联缺失仅产生较短序列而不会造成框架移位、破坏MQ交替结构，因而相较单体路线优势显著。

（二）长DMFOs的固相合成。研究团队在进一步降低载量的Tentagel树脂上实现全自动SPFS，合成了72至100单元的序列，如含Q₅Pho的100mer 27，分子量约34.5 kDa，相当于300个氨基酸的蛋白质。随链延长截短序列比例逐渐上升，32mer阶段几乎无截短物，至100mer阶段截短物成为最大色谱峰，但100mer仍为主产物；经C8柱RP-HPLC纯化获得90 mg产物，仅耗时2天，且投入过量单体的49%可回收，证明该路线快速高效。

（三）折叠体分析。RP-HPLC、¹H NMR、CD与MS确认了各序列的身份与纯度。研究表明，单一BRMe手性单元即可控制(MQ)_n螺旋的旋向；72mer 40经55°C加热20小时热退火后，其CD谱与16mer相当，实现了接近定量的M螺旋偏向。DLS与cryo-EM显示，Ca²⁺驱动DMFOs形成间距规则的有序聚集体（簇重建分辨率13.29 ?），而EDTA可螯合二价离子、消除聚集。

（四）INO80^A-module–DMFO结合分析。BLI显示生物素化72mer DMFO 31与39结合INO80^A-module的解离常数K_D为1.4–1.8 nM，较36 bp dsDNA强3至6倍，且结合不受盐浓度影响；EMSA进一步表明DMFO在更低蛋白浓度下即可形成复合物，与BLI结果一致，支持DMFO与DNA结合蛋白结合的固有优势。

（五）INO80^A-module–DMFO复合物的低温电镜结构分析。cryo-EM以3.59 ?分辨率解析了72mer 40与INO80^A-module的复合物：DMFO占据DNA结合区域，整体表现与B-DNA相似，但其结合于Arp8亚基与Ino80 HSA2结构域，而非DNA所结合的Ino80 HSA1与Arp8 N端；电子密度略短于分子模型预测的全长螺旋。在C模块中，foldamer与Arp5、Rvb1/2相关，但未能获得清晰电子密度。

四、讨论与结论

研究人员总结认为：基于二聚大分子单体的SPFS可高效合成最长100个单元的水溶性DMFOs，偶联效率优异，截短与插入副产物可忽略；单一立体中心即可控制如此之长的螺旋旋向，立体ogenic中心处CH₃与H的区分即可决定整条螺旋的手性；Ca²⁺介导的聚集可通过cryo-EM直接观察并验证foldamer的尺寸与杆状特性；长DMFOs比DNA本身更强地结合INO80^A-module，且以更小的蛋白质-折叠体接触面积、无需弯曲foldamer即可发生结合。该工作的重要意义在于证明DMFOs可作为干扰染色质重塑体等超大蛋白复合体功能的新型药理工具，尽管其具有良好的稳定性；同时指出，提升DMFOs的细胞内递送效率（如PULsin或抗体-偶联物转染试剂）以及突破单一(MQ)_n重复基序、实现序列选择性（如DMFO-DNA杂交分子或新型M、Q单体类似物）是后续研究需要面对的挑战。