《Oxygen》：Salicylic Acid Pretreatment Reprograms the Subsequent Drought Stress Response of Tomato: Integrated Transcriptomic and Biochemical Evidence for Long-Term Stress Priming
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干旱是作物生产中最为关键的限制因素之一。本研究探讨了水杨酸（salicylic acid，SA）预处理如何改变番茄（Kecskeméti 549）后续干旱胁迫响应。研究人员设置了四组处理（对照组、干旱胁迫组、SA预处理组以及SA预处理并干旱胁迫组），基于RNA
干旱是作物生产中最为关键的限制因素之一。本研究探讨了水杨酸（salicylic acid，SA）预处理如何改变番茄（Kecskeméti 549）后续干旱胁迫响应。研究人员设置了四组处理（对照组、干旱胁迫组、SA预处理组以及SA预处理并干旱胁迫组），基于RNA测序的全基因组转录组分析（n = 3）及抗氧化酶活性测定（过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶；POX、CAT、GR、GST、SOD）进行比较研究。此外，还分析了叶绿素含量及脯氨酸、丙二醛（MDA）、蛋白质含量、总酚、总黄酮和可溶性糖等生化指标。SA处理和干旱胁迫均引起了广泛的基因表达重排，主要涉及氧化还原稳态、信号转导、蛋白质稳态以及氨基酸、碳水化合物和能量代谢相关基因。在干旱条件下，SA预处理植株的转录胁迫响应更为缓和（诱导的分子伴侣、蛋白酶体、防御和氧化还原基因较少），而若干SA依赖性WRKY转录因子（WRKY70、WRKY41、WRKY51、WRKY60）表现出诱导响应——与未处理植株中观察到的模式相反。此外，该组五种抗氧化酶的活性均为最高（双因素方差分析，处理×胁迫交互作用）。编码这五种抗氧化酶的基因转录水平与其相应酶活性呈强相关（r = 0.85）。干旱胁迫使未处理植株的叶面积减少24.6%，MDA含量增加2.6倍，蛋白质含量降低79.3%。但在SA预处理植株中，叶面积未减少，MDA含量未增加，蛋白质损失较低（35.3%）。这些结果表明SA诱导了持续性的启动效应。
论文解读：水杨酸预处理对番茄干旱胁迫响应的长期启动效应——整合转录组与生化证据
一、研究背景与科学问题
干旱是制约全球作物生产最严峻的非生物胁迫因子之一。随着气候变化加剧，干旱事件频发且强度增加，对粮食安全构成持续威胁。传统农业依赖灌溉和抗旱品种选育，但水资源日益紧张，亟需开发可持续、环境友好的作物保护策略。植物自身防御机制的高效调控成为研究热点，其中“胁迫启动”或“免疫启动”概念自Jones和Dangl（2006）提出植物先天免疫两步模型后受到广泛关注。启动效应指植物在经历特定刺激后，其后续对胁迫的响应发生改变，表现为更迅速或更强烈的防御激活，或更温和的损伤程度。
水杨酸是植物防御响应中的核心信号分子，在生长调控、胁迫响应、抗氧化防御和免疫激活中发挥多重作用。SA通过NPR1受体蛋白及其旁系同源物（NPR3、NPR4）感知信号，与TGA类转录因子形成增强体复合物，激活防御基因表达，并触发WRKY等次级转录因子的级联反应。SA信号与细胞氧化还原状态紧密关联，NPR1的核转位受SA诱导的还原状态调控。然而，外源SA预处理是否能在时间间隔后持续改变植物对后续干旱胁迫的转录组和生化响应，其分子机制尚不明确。现有研究多关注SA的即时效应，对SA预处理后植物在后续胁迫中表现出的“启动状态”缺乏系统性的全基因组水平解析。
本研究旨在回答核心科学问题：在SA处理与后续干旱胁迫之间存在显著时间间隔的条件下，SA预处理是否形成一种持久的生理和分子状态，从而改变植物对干旱的转录和生化响应？研究采用四组处理设计（非胁迫对照、干旱胁迫对照、SA处理、SA预处理后干旱胁迫），系统比较SA的独立效应、干旱胁迫效应以及二者交互作用，从转录组和生化水平揭示SA启动效应的分子基础。
二、研究设计与关键方法
研究人员选用匈牙利培育的番茄品种Kecskeméti 549（K-549）作为实验材料。种子经表面消毒后播种，51天后移栽至装有土壤-泥炭混合物（1:1，w/w）的塑料盆中，温室条件下培养。移栽23天后（2025年6月17日），对指定组别进行100 mg/L SA叶面喷施处理，每株约30 mL溶液。干旱胁迫于SA处理后第7天开始，持续14天（2025年6月24日至7月7日），胁迫组灌水量为对照组的50%。第二次采样（2025年7月7日）在胁迫结束时进行，此时植株处于营养生长末期、即将进入生殖生长阶段。
研究采用的主要技术方法包括：基于Illumina NovaSeq 6000平台的RNA测序（RNA-seq）转录组分析，12个独立文库（四组处理×三个生物学重复）；利用Trinity软件进行de novo转录组组装；通过OmicsBox BioBam 3.4软件进行BLAST比对、基因本体（GO）注释和EggNOG功能注释；采用NOISeq-bio算法进行差异表达基因（DEG）鉴定，筛选标准为概率>0.9且|M|≥1（约两倍表达变化）；KEGG和Plant Reactome数据库进行通路分析；转录因子家族富集分析采用Fisher精确检验并Benjamini-Hochberg校正。实验室测定包括五种抗氧化酶（POX、CAT、GR、GST、SOD）活性、脯氨酸含量、MDA含量、可溶性糖、总酚（TPC）、总黄酮（TFC）含量、蛋白质含量、叶面积、株高、茎粗和SPAD叶绿素值。统计分析采用双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey HSD事后检验，基因表达与酶活性关系采用Pearson相关分析。
三、主要研究结果
3.1 转录组学与全基因组分析
de novo组装获得14,027条转录本，鉴定并功能注释11,585个基因。四组比较共鉴定大量差异表达序列：对照干旱比较（Ctrl_non_stressed vs. Ctrl_stressed）中6,927条（2,765上调，4,162下调）；SA单独效应比较（Ctrl_non_stressed vs. SA_non_stressed）中7,303条（2,659上调，4,644下调）；干旱条件下SA效应比较（Ctrl_stressed vs. SA_stressed）中6,970条（2,377上调，4,593下调）；SA预处理植株干旱响应比较（SA_non_stressed vs. SA_stressed）中6,743条（2,606上调，4,137下调）。所有比较中下调序列数均超过上调序列数。
3.1.1 功能与基因本体分析
KEGG通路分析显示，受影响最频繁的通路包括半胱氨酸和蛋氨酸代谢（每比较下调基因17-23个）、淀粉和蔗糖代谢（15-19个）以及糖酵解/糖异生（11-20个）。此外，丙酮酸、嘌呤和卟啉代谢、谷胱甘肽代谢和卡尔文循环也涉及大量基因。四个比较中下调基因均占主导地位。维恩图分析显示，上调基因列表中有73个基因在所有四个比较中共同出现，而下调基因列表中有198个共同基因。
3.1.2 干旱胁迫和SA处理的转录组效应
未处理对照植株的干旱响应表现为氧化还原稳态、碳代谢、氨基酸代谢和光合作用相关基因的协调性平行重组。SA单独处理（处理后20天评估）与光合装置相关基因（叶绿素a/b结合蛋白、光系统亚基、Rubisco小亚基）、卡尔文循环和核糖体蛋白基因的高表达相关；相反，大量胁迫信号和防御基因（WRKY和ERF型转录因子、NDR1/HIN1样和CDPK基因、热休克蛋白、过氧化物酶、谷胱甘肽S-转移酶、苯丙烷途径酶）表达低于未处理对照。在干旱条件下，SA预处理植株中热休克蛋白和分子伴侣（包括BiP）、蛋白酶体-泛素系统组分、PR和其他防御蛋白以及氧化还原调控基因（抗坏血酸过氧化物酶、谷氨还蛋白、硫氧还蛋白、GST）的表达显著低于未处理干旱对照，表明预处理植株的转录胁迫响应更为温和。
3.1.3 差异表达基因中转录因子的富集
在注释转录本中鉴定出182个转录因子，最丰富的家族为WRKY（22）、AP2/ERF/DREB（20）、bHLH（13）、HD-ZIP/同源异型盒（12）、MYB（11）、B-box（9）、GRAS（9）和NAC（8）。WRKY因子在对照干旱响应和SA单独效应的下调基因列表中均显著富集。在SA预处理植株的干旱响应中，无单个转录因子家族显著富集，但若干SA依赖性WRKY因子（WRKY70、WRKY41、WRKY51、WRKY60）在未处理对照中干旱条件下表达下降，而在SA预处理植株中干旱条件下表达上升并达到高于未处理干旱对照的水平。这种响应方向的逆转可能作为启动状态的转录特征。
3.2 生长和叶绿素参数
最终采样时，SA预处理的主效应在全部四个参数（叶绿素含量、株高、叶面积、茎粗）上显著，干旱主效应在除茎粗外的三个参数上显著。干旱使未处理植株的叶绿素含量、株高和叶面积降低（叶面积减少24.6%），而SA预处理植株的株高和叶面积未显著下降，叶绿素含量在两种供水水平下均高于未处理对照。叶面积和茎粗存在显著的处理×胁迫交互作用。
3.3 抗氧化系统的转录和生化表征
转录水平（NOISeq）与以鲜重为基准的酶活性之间呈强相关（r = 0.85；p < 0.0001；n = 20），五种酶各自也呈正相关（r = 0.74-0.99）。双因素方差分析显示，五种酶的处理主效应均显著（p < 0.0001），POX、GR和SOD的胁迫主效应显著，五种酶的处理×胁迫交互作用均显著。SA+干旱组的五种酶平均活性均为最高。蛋白质含量在各处理间变化剧烈：未处理干旱植株蛋白质含量较非胁迫状态下降79.3%，而SA预处理干旱组损失较温和（35.3%），剩余蛋白质含量约为未处理干旱对照的4倍。以蛋白质含量归一化的比活性在未处理干旱组中最高（四种酶），但比活性与基因表达无显著相关（r = -0.06），因此以鲜重为基准的活性被确定为主要验证指标。
3.4 附加生化胁迫标记物
六项生化参数均观察到显著的处理和胁迫主效应及交互作用。干旱使未处理植株MDA含量增加2.6倍，但SA预处理植株的MDA水平未升高，且该组数值显著低于其他所有组。脯氨酸含量在未处理植株中干旱响应时增加63.2%，但在预处理植株中下降18.4%。可溶性糖、总酚和总黄酮含量在两种植株中均随干旱增加，但预处理组的绝对值在两种胁迫水平下均低于相应对照组。
3.5 基因集水平基因表达与生化参数的相关性
蛋白质含量与编码核糖体蛋白的基因集表达呈正相关（214个基因；r = 0.54；经验p < 0.001），MDA含量与抗氧化酶基因集表达呈正相关（98个基因；r = 0.48；经验p = 0.012）。脯氨酸代谢、苯丙烷生物合成、黄酮生物合成、糖代谢和光合/叶绿素相关基因集的相关性未显著偏离随机基因集。抗氧化酶相关基因集与酶活性呈负相关，但除过氧化氢酶外均未显著偏离随机结果。这一结果与单基因水平分析的正相关不同，归因于亚型特异性调控以及转录后和翻译后调控机制。
四、讨论与结论
研究讨论部分整合了转录组和生化结果，提出SA预处理通过多层面调控重塑番茄干旱响应。SA单独处理20天后，急性SA信号响应已消退，防御相关转录状态未持续激活，但四种抗氧化酶活性仍显著升高，光合和生物合成能力增强，表明植物处于“待命”的启动状态而非持续防御状态。在后续干旱胁迫中，SA预处理植株表现出更温和的转录胁迫响应——分子伴侣、蛋白酶体组分、防御蛋白和氧化还原基因的诱导程度较低，MDA水平未升高，蛋白质损失较小，表明预处理植株实际经历的氧化和细胞损伤程度较低。
SA预处理植株干旱响应中SA依赖性WRKY因子的诱导（与未处理对照中的抑制相反）以及染色质调控基因（JMJ26样组蛋白去甲基化酶、组蛋白基因）的差异表达，提示表观遗传机制可能参与启动状态的形成，但研究明确指出这仅为转录水平的间接证据。脯氨酸含量在预处理植株中下降而非积累，研究人员引用文献指出脯氨酸积累量本身并非胁迫耐受性的可靠指标，脯氨酸代谢的稳态平衡而非积累量才是生物学相关因素，并提出两种非互斥解释：预处理植株因抗氧化酶活性升高和蛋白质损伤减少而经历较轻的渗透胁迫，或SA改变了脯氨酸代谢本身的调控平衡。
总酚、总黄酮和可溶性糖在预处理组中绝对值较低的现象被归因于资源再分配假说：SA预处理植株将防御资源优先分配给酶促抗氧化系统，而非苯丙烷/莽草酸途径来源的非酶促酚类和黄酮类物质。这与生长-防御资源再分配原则一致。
研究明确区分了启动效应与胁迫记忆的概念。SA预处理与后续干旱胁迫之间存在显著时间间隔，预处理植株的干旱响应在转录组和生化水平上均不同于未处理植株，这符合长期启动效应的定义。但研究人员强调，要证实经典意义上的胁迫记忆，需要胁迫解除后恢复期变化的直接证据或重复胁迫响应的检验，这些未包含在当前实验设计中。因此，结果被最准确地解释为SA诱导的持久启动效应，而非直接证明的胁迫记忆。
研究结论指出，SA预处理显著改变了番茄干旱响应的调控架构。经典胁迫响应——氧化胁迫管理、渗透适应和代谢重排——并未被SA预处理消除，而是在不同的转录和生化环境中以不同的调控模式发生。转录组和酶活性结果共同支持SA预处理创建了一种启动的防御状态，该状态在后续干旱期间改变了信号传导、抗氧化防御、蛋白质稳态和初级代谢。该研究为SA作为作物抗旱生物刺激剂的机制理解提供了全基因组水平的证据基础，并强调了数据归一化方法（鲜重基准vs.蛋白质基准）在植物生理酶活性测定中的关键方法论意义。
