《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：A Polyelectrolyte-Functionalized Siloxane Biointerface for BV2 Microglial Culture
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•BEASTS结合了合规的Sylgard 527与PDAC/SPS多层界面。•表面测量支持多层结构构建和润湿性变化。•MTT活性随培养基、GM-CSF和时间而变化。•BV2细胞在不同培养条件下的积累量随时间而变化。•在三种测试的qRT-PCR条件下，有六种BV2转录本存在差异。引
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BEASTS结合了合规的Sylgard 527与PDAC/SPS多层界面。
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表面测量支持多层结构构建和润湿性变化。
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MTT活性随培养基、GM-CSF和时间而变化。
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BV2细胞在不同培养条件下的积累量随时间而变化。
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在三种测试的qRT-PCR条件下，有六种BV2转录本存在差异。
引言
细胞外环境的机械性质通过机械转导调节细胞行为，这一过程中基底材料的柔韧性会影响整合素的结合、细胞骨架的组织以及下游的转录输出[1]、[2]、[3]。在中枢神经系统中，脑实质的体积弹性模量大约为0.1至5 kPa[3]，这个范围比大多数工程生物材料要软得多，也远低于周围组织的柔韧性。居住在这种环境中的细胞，包括小胶质细胞，据信会根据局部机械信号调整其粘附受体表达、形态和功能状态[5]。
小胶质细胞是大脑的主要先天免疫细胞，也是中枢神经系统中最对机械变化敏感的细胞之一[5]。在稳态条件下，它们呈现出分支状的形态，并表达一组特征性的稳态标志物，包括fractalkine受体CX3CR1和补体受体ITGAM（CD11b）[6]。CX3CR1的表达是调节小胶质细胞稳态的关键因素，而CX3CR1表达的降低与衰老和疾病相关的小胶质细胞状态有关[6]、[7]。体外小胶质细胞行为的模型在施加特定实验刺激之前，需要将细胞维持在代表其体内稳态条件的基线状态。
用于小胶质细胞培养的主要生物界面是组织培养聚苯乙烯（TCPS），其杨氏模量大约在几吉帕范围内[8]。这种基底的硬度比生理脑实质的硬度高出大约五到六个数量级。在刚性基底上，整合素介导的粘附会导致形成大的、成熟的焦点粘附复合体，通过肌动蛋白-肌球蛋白收缩产生显著的细胞骨架张力[9]。这种信号传导机制表明，基质硬度可以调节炎症反应，刚性基质在炎症刺激下会增强氧化应激和炎症激活[10]。最近的研究还强调，细胞-材料相互作用不仅受杨氏模量的影响，还受粘附几何形状、纳米级表面纹理、表面结构以及与软组织生物学相关的界面化学性质的影响[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。因此，在小胶质细胞培养中，基底的机械和界面性质可能是潜在的混杂变量，可能会独立于任何实验处理而提高基线的炎症活性。
软质聚丙烯酰胺水凝胶基底已被用于体外模拟类似大脑的柔韧性[16]；然而，它们的表面功能化需要共价结合粘附蛋白，并且它们在小胶质细胞培养中的应用通常依赖于来自原代星形胶质细胞或混合胶质细胞的培养基。这种培养基会引入不确定的可溶性因素，这些因素会独立调节小胶质细胞的状态，从而难以将这种影响与基底的机械效应区分开来。等离子辅助的表面修饰方法，包括射频氧等离子体活化、PECVD沉积和大气等离子体处理，是一类在聚合物基底上生成定义明确、可重复粘附界面的成熟技术[17]、[18]、[19]。另一种方法是设计一种表面，结合了生理上相关的柔韧性和明确的非蛋白质粘附化学性质，而不引入额外的受体激活配体。
在这里，我们描述了BEASTS（基于生物工程粘附硅氧烷的可调硬度），这是一种基于合规的Sylgard 527的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底，通过等离子辅助的逐层沉积交替的PDAC和SPS聚电解质双层来功能化。这一实现基于之前的Sylgard 527/PDAC-SPS生物界面研究[20]，并将该平台应用于BV2小胶质细胞培养，进行了扩展的机械、表面和转录水平表征。PDAC/SPS多层结构提供了一个带电的、亲水性的界面，旨在无需培养基或粘附蛋白涂层即可支持细胞附着；与细胞表面的静电相互作用是一个可能的贡献因素，但在这里没有直接测试。我们报告了BV2细胞在11天培养期间的代谢活性、细胞积累和转录水平响应，并比较了完整的BEASTS和TCPS培养系统。作为未来应用的可能性，讨论了该平台的潜在模块化扩展，而不仅仅是当前单一配方研究所展示的功能。
章节摘录
细胞系和常规维护
BV2小鼠小胶质细胞（传代23-25；延长传代的潜在影响在4.3节中得到了承认和讨论）在完全生长培养基中维持，该培养基包括DMEM:F12，添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS；Bio-Techne，目录号S11150）、1%非必需氨基酸（NEAA；Thermo Fisher Scientific，目录号SH30238）、1%丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，目录号11360070）以及100 U/mL青霉素和100 ug/mL链霉素（Thermo Fisher Scientific）
BEASTS生物界面设计和表面功能化
BEASTS平台旨在解决TCPS与脑实质之间的巨大机械不匹配问题。报道的Sylgard 527配方质量比为1:1，其低千帕范围内的测量值取决于测试方法、涂层状态和加载条件。已发表的测量结果显示，纯Sylgard 527基PDMS基底的杨氏模量为5.05±0.37 kPa（通过单轴拉伸测试），而PEM涂层的100% Sylgard 527基底的杨氏模量为2.4±0.03 kPa（通过压痕测试）[20]、[21]。
整合的BEASTS界面和BV2细胞响应
本研究的一个主要解释性边界是，BEASTS和TCPS在底层材料、机械响应、表面化学性质、表面润湿性和蛋白质吸附行为方面存在差异。因此，当前的设计无法单独分离任何单一材料属性的贡献。要区分这些贡献，需要匹配的对照实验，如PDAC/SPS涂层的TCPS、未涂层的Sylgard 527、经过等离子处理的未涂层Sylgard 527、或蛋白质涂层的BEASTS等。
结论
开发了一种合规的PDAC/SPS功能化Sylgard 527生物界面，用于BV2小胶质细胞培养，在代表性的原子力显微镜（AFM）测量中显示出相对于TCPS的明显质量-压痕对比。表面表征数据支持PDAC/SPS多层结构的形成、组装过程中的预期润湿性变化、表面粗糙度的增加、特征性的元素特征、累积的干膜生长、带负电荷的最终表面以及测量接触角的持久性。
利益冲突
作者声明他没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能会影响本文报告的工作。
支持本研究发现的数据可向相应作者请求获得。
CRediT作者贡献声明
Timothy Hackett：撰写——原始草稿、验证、软件、方法论、调查、正式分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明他没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能会影响本文报告的工作。
致谢
作者感谢Paul Blum博士提供BV2小胶质细胞系，以及Srivatsan Kidambi博士提供实验室资源、基础设施和用于生成图1的学术BioRender订阅服务。这项工作是在内布拉斯加大学林肯分校的Kidambi实验室进行的。资金由NIH 1R01AA027189-01A1（NIAAA）、NIH P20GM113126（CIBC-NIGMS）、NIH P20GM104320（NPOD-NIGMS）、国防部CDMRP发现奖（授予S.K.）以及内布拉斯加大学提供。
Timothy A. Hackett
