《Journal of Obstetrics and Gynaecology》：microRNA-614 contributes to recurrent miscarriage through targeting FOXD1
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目的：复发性流产（recurrent miscarriage，RM）是影响许多育龄女性生殖健康的重要问题。本研究旨在评估microRNA-614（miR-614）作为RM潜在生物标志物的价值，并阐明其功能机制。方法：首先采用生物信息学方法从基因表达综合数据库（
目的：复发性流产（recurrent miscarriage，RM）是影响许多育龄女性生殖健康的重要问题。本研究旨在评估microRNA-614（miR-614）作为RM潜在生物标志物的价值，并阐明其功能机制。方法：首先采用生物信息学方法从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中筛选差异表达miRNA（differentially expressed miRNAs，DEmiRs）。纳入135例RM患者和135例健康对照。采用逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）和受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析评估miR-614的表达水平及诊断效能。采用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）和Transwell实验评估该miRNA对滋养细胞增殖、侵袭和迁移的影响。为验证靶基因，使用TargetScan 8.0进行预测，随后通过荧光素酶活性实验确认miRNA的直接调控作用。结果：对GSE73025数据集的生物信息学分析显示miR-614显著下调。RM患者血浆miR-614显著下调。miR-614区分RM患者与对照的ROC曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）为0.865（95%置信区间（confidence interval，CI）：0.823–0.907，敏感度=77.78%，特异度=77.78%）。预测不良妊娠结局的AUC为0.790（95% CI：0.708–0.870，敏感度=71.08%，特异度=82.69%）。转染miR-614模拟物可降低HTR-8和JEG3细胞的增殖、侵袭和迁移。miR-614直接靶向FOXD1并负向调节其mRNA表达，从而驱动RM进展。结论：在RM患者中，miR-614下调导致FOXD1表达增加。miR-614模拟物通过直接靶向FOXD1抑制滋养细胞增殖、迁移和侵袭。因此，miR-614下调通过直接靶向FOXD1，进而上调FOXD1并抑制滋养细胞增殖、侵袭和迁移，参与RM发病机制。
复发性流产（recurrent miscarriage，RM）是影响育龄女性生殖健康的重要问题，约影响2.5%育龄女性。已知病因包括遗传因素、生殖道解剖异常、免疫功能障碍和内分泌紊乱，但近50%的RM病例仍原因不明，亟需识别新的分子机制和生物标志物。胎盘上皮中的滋养细胞（trophoblast cell）具有增殖、趋化和侵袭能力，是胎儿营养供给所必需；滋养细胞侵袭失调可导致胎盘形成不足，并与子痫前期、胎儿生长受限、胎盘钙化、妊娠滋养细胞疾病甚至RM相关。微小RNA（microRNA，miRNA）已被确立为多种妊娠相关状况的生物标志物，其失调参与RM发病；多种miRNA可调控滋养细胞侵袭和增殖。然而，许多miRNA在RM中的作用尚未探索。研究人员通过挖掘GSE73025数据库发现miR-614在早期RM绒毛组织中显著失调；miR-614在肿瘤生物学中可调节细胞增殖和侵袭，但其在RM中的表达、临床价值和功能尚未研究。叉头框D1（forkhead box D1，FOXD1）是转录因子，此前与不良妊娠结局相关。因此，研究人员评估血浆miR-614表达及其诊断和预后价值，并研究miR-614通过靶向FOXD1对滋养细胞增殖、迁移和侵袭的功能影响。
关键方法概括：研究人员从基因表达综合数据库（GEO）的GSE73025数据集（15例早期RM绒毛组织和15例正常早期妊娠绒毛组织）经生物信息学筛选差异表达miRNA（DEmiRs）。临床队列来自四川锦欣西囡妇女儿童医院2021年1月至2024年12月，纳入135例RM患者和135例年龄、孕周匹配的健康妊娠对照，并按结局分为良好83例和不良52例。采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测血浆miR-614和FOXD1 mRNA，受试者工作特征（ROC）曲线评估诊断和预后效能；以细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和Transwell实验评估HTR-8和JEG3细胞增殖、迁移和侵袭；以TargetScan 8.0预测、双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系。
基线特征（Baseline characteristics of RM patients and controls）：研究纳入135例RM患者和135例健康对照，对照在年龄、BMI和孕周与病例匹配（P>0.05）；RM组平均流产次数（3.01±0.31）和hCG水平（52349.38±27177.55 IU/L）高于对照（0；25325.03±11765.34 IU/L，P<0.001）。通过临床资料比较得出两组基线特征。
miR-614在RM患者中降低（miR-614 decreased in RM patients）：GSE73025筛选出25个差异表达miRNA（15个上调、10个下调），miR-614显著下调；RT-qPCR显示RM患者血浆miR-614低于对照（P<0.001）；ROC分析显示AUC=0.865（95% CI：0.823–0.907），敏感度77.78%，特异度77.78%，提示miR-614有区分RM与健康对照的潜力。
不良妊娠结局患者中miR-614表达降低（Decreased miR-614 expression in patients with poor pregnancy outcomes）：良好结局组83例、不良结局组52例，年龄、BMI、孕周无显著差异；不良结局组平均流产次数（3.12±0.38 vs 2.94±0.24，P<0.001）和hCG水平（61643.88±28267.00 vs 46526.31±24918.96 IU/L，P<0.001）高于良好组；RT-qPCR显示不良结局组血浆miR-614显著降低（P<0.001）；ROC分析显示AUC=0.7895（95% CI：0.708–0.870），敏感度71.08%，特异度82.69%，提示miR-614有区分不良结局的潜力。
miR-614调控细胞增殖、侵袭和迁移（miR-614 Regulates cell proliferation, invasion, and migration）：转染miR-614模拟物后HTR-8和JEG3细胞miR-614丰度显著升高（P<0.0001）；CCK-8显示两种滋养细胞生长速率降低（P<0.001）；Transwell显示迁移和侵袭能力显著降低（P<0.0001）；提示miR-614上调抑制滋养细胞活力，参与RM发病。
FOXD1是miR-614的功能性下游靶点（FOXD1 is the functional downstream target of miR-614）：TargetScan 8.0预测FOXD1 3′UTR存在miR-614结合位点；共转染miR-614模拟物与FOXD1-wt显著降低相对荧光素酶活性（P<0.0001）；转染模拟物后FOXD1表达显著下调（P<0.0001）；RM样本FOXD1 mRNA显著升高（P<0.0001），135例RM患者血浆miR-614与FOXD1水平呈强负相关（r=?0.640，P<0.0001）；表明miR-614负调控FOXD1并参与RM发生。
讨论部分总结：约一半RM患者病因未明，阻碍精准个体化治疗，并造成家庭痛苦和社会经济负担，因此阐明机制对RM治疗重要。本研究识别RM患者miR-614显著下调，过表达miR-614通过FOXD1抑制滋养细胞功能，进而调控RM发展。GSE73025绒毛组织发现miR-614下调，血浆验证其下调；低miR-614可区分RM与对照，并可区分RM队列中良好与不良妊娠结局。早期妊娠中，绒毛外滋养细胞具有高度趋化和穿透能力，类似肿瘤细胞；病理状态下滋养细胞功能障碍被广泛认为是不良妊娠结局的原因。有研究报道miR-150-5p在绒毛组织和血清中上调，通过靶向VEGFA抑制HTR-8迁移，促进RM发生；本研究用miR-614模拟物升高HTR-8和JEG3细胞内水平，过表达显著降低两种细胞增殖和运动，提示miR-614可能通过调控滋养细胞增殖和迁移参与RM。TargetScanHuman 8.0识别FOXD1为miR-614候选靶点；FOX转录因子属于B-winged helix超家族，成员含进化保守的winged helix-loop-helix DNA结合域；FOXD1位于人类染色体5q12-q13，与癌症和胚胎植入等关键生物学过程相关，并被认为是调节妊娠维持的潜在新分子参与者，其突变与人类RM相关。荧光素酶实验证明miR-614可靶向并结合FOXD1；本研究中RM患者血浆FOXD1水平上调且与miR-614负相关；Li et al.证明miR-30a直接结合FOXD1，参与前列腺癌发病和进展；这些结果提示miR-614可能下调FOXD1表达，从而参与RM发病。局限性包括：仅进行miR-614功能获得实验，缺乏功能缺失（miR-614抑制剂）和挽救实验（miR-614模拟物与FOXD1共转染），miR-614/FOXD1轴证据链尚不完整；差异表达数据来自绒毛组织，临床验证使用外周血，但胎盘来源miRNA可通过外泌体释放入母体循环，使外周血miR-614反映母胎界面病理生理；JEG3为绒毛膜癌细胞系，与正常原代滋养细胞行为不同；样本来自单中心且样本量有限，推广性受限，未来需大规模多中心队列；对照为意外妊娠终止女性，可能不能完全代表一般产科人群，未来应纳入计划妊娠并活产的健康的孕妇作为对照；尚未成功分离人原代滋养细胞，未来将克服技术挑战。
研究结论（译）：综上，miR-614在RM中下调，可区分RM患者，也可分类不良结局；过表达miR-614通过直接结合FOXD1降低HTR-8和JEG3细胞增殖和运动；研究表明，下调的miR-614通过直接靶向并上调FOXD1抑制HTR-8和JEG3细胞增殖和运动，最终促进RM发生。
