《Journal of Obstetrics and Gynaecology》：Steroid 5α-reductase 2 and StAR protein expression in ovaries of rats with polyendocrine metabolic ovarian syndrome
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背景 多内分泌代谢性卵巢综合征（PMOS），旧称多囊卵巢综合征，以高雄激素血症、排卵功能障碍及代谢紊乱为特征。类固醇5α-还原酶2（SRD5A2）可催化睾酮转化为双氢睾酮（DHT），后者为强效雄激素受体激动剂。然而，SRD5A2在PMOS女性卵巢中的表达特征及
背景 多内分泌代谢性卵巢综合征（PMOS），旧称多囊卵巢综合征，以高雄激素血症、排卵功能障碍及代谢紊乱为特征。类固醇5α-还原酶2（SRD5A2）可催化睾酮转化为双氢睾酮（DHT），后者为强效雄激素受体激动剂。然而，SRD5A2在PMOS女性卵巢中的表达特征及其对高雄激素血症的潜在贡献尚不明确。本研究旨在探讨SRD5A2与类固醇生成急性调节蛋白（StAR）在PMOS大鼠模型卵巢中的表达，并探究其与血清激素水平的关联。方法 将大鼠随机分为三组：PMOS组（n=20）、模型对照组（二甲基亚砜[DMSO]；n=10）及空白对照组（BC；n=10）。PMOS模型通过皮下注射脱氢表雄酮建立。采用阴道细胞学评估动情周期。采用酶联免疫吸附试验定量检测血清激素。分别采用蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链反应评估卵巢组织中SRD5A2与StAR的蛋白及mRNA表达水平。结果 与BC组及DMSO组相比，PMOS组大鼠体重显著增加（P<0.05），动情周期紊乱，血清抗苗勒管激素、睾酮、促黄体生成素（LH）水平及LH/卵泡刺激素（FSH）比值显著升高（P<0.05）。PMOS组卵巢中SRD5A2与StAR的蛋白及mRNA水平较BC组和DMSO组显著上调（P<0.05）。各组间卵巢体积与重量相似，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 SRD5A2与StAR在PMOS大鼠卵巢中高表达，并与高雄激素血症及LH分泌升高相关。上述发现提示SRD5A2与StAR可能参与PMOS的发病机制，但其因果关系仍需进一步研究加以确立。
多内分泌代谢性卵巢综合征（PMOS）是育龄期女性常见的内分泌代谢紊乱性疾病，全球患病率约为5%–22%，其临床特征主要包括高雄激素血症、稀发排卵或无排卵及多内分泌代谢性卵巢功能障碍。尽管该病确切发病机制尚未阐明，但大量证据表明高雄激素血症在其病理生理过程中发挥核心作用。既往研究已明确PMOS的高雄激素血症归因于卵巢卵泡膜细胞内在功能障碍，PMOS女性卵泡膜细胞中类固醇生成酶表达增加且雄激素生成能力增强。类固醇5α-还原酶2（SRD5A2）是类固醇代谢中的关键膜整合酶，可催化睾酮转化为双氢睾酮（DHT），后者是激活雄激素受体的主要类固醇激素。SRD5A2缺乏与性发育障碍相关，而其过度产生则与良性前列腺增生和前列腺癌相关，上述过程由雄激素受体信号过度激活所致，该酶抑制剂已成为SRD5A2过度产生相关疾病的一线抗雄激素疗法。然而，该酶在PMOS女性卵巢中的表达特征及其对高雄激素血症的潜在贡献尚不清楚。值得注意的是，SRD5A1是人卵巢中表达的主要亚型，且5α-还原酶在卵巢卵泡颗粒细胞中的表达高于卵泡膜细胞，提示大部分5α-还原酶活性依赖于卵泡膜细胞释放并被颗粒细胞摄取的雄激素前体，卵巢DHT的产生可能涉及区室间协作而非仅发生于卵泡膜细胞内。在卵巢类固醇生成过程中，由类固醇生成急性调节蛋白（StAR）介导的胆固醇从线粒体外膜向内膜的转运是性激素合成的限速步骤，StAR在促黄体生成素（LH）等因子刺激下快速合成，是类固醇激素合成急性期的主要调节蛋白。因此，研究调控StAR表达与性激素产生的分子机制对于深入理解PMOS类固醇生成具有重要意义。基于此，本研究旨在探讨PMOS大鼠卵巢中SRD5A2与StAR表达及其与血清激素水平的关联，以阐明PMOS的发病机制，并假设SRD5A2与StAR在PMOS大鼠卵巢中过表达且其过表达与高雄激素血症及LH分泌升高相关。脱氢表雄酮（DHEA）诱导大鼠模型因可重现PMOS的多个关键特征而被广泛使用，包括高雄激素血症、动情周期紊乱、LH/FSH比值升高及多囊卵巢形态，这与青春期前雌性小鼠DHEA处理不能稳定重现完整PMOS表型形成对比。研究人员开展了实验动物研究，于2024年3月至6月在福建卫生职业技术学院实验动物中心进行，所有操作遵循ARRIVE指南。研究使用40只SPF级21日龄雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，适应2天后采用计算机生成的随机数字序列随机分为PMOS组（n=20）、模型对照组（DMSO；n=10）和空白对照组（BC；n=10）。PMOS组每日16:00于颈背皮下注射DHEA（6 mg DHEA溶于0.2 mL DMSO/100 g体重），连续20天，同期采集阴道涂片监测动情周期变化并评估造模成功与否；DMSO组每日注射等体积DMSO，其余操作相同；BC组连续20天采集阴道涂片监测动情周期。第20天20:00至次晨08:00禁食，次日08:00采集阴道涂片后经腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血2 mL，低温离心获取血清，采用特异性酶联免疫吸附试验试剂盒测定抗苗勒管激素（AMH）、睾酮、雌二醇、孕酮、LH及FSH水平；同时获取双侧卵巢，称重并测量长径（L）与短径（S），按V=4.19×[(L+S)/2]3计算卵巢体积，随后液氮速冻用于后续分析。每组随机选取3只大鼠（生物学重复n=3）取左卵巢用于蛋白分析，每个样本设三个技术重复；卵巢于液氮中研磨，冰上RIPA裂解液裂解后离心获取总蛋白上清，BCA法测定蛋白浓度，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%分离胶、5%浓缩胶）分离并以200 mA恒流70分钟转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭后与SRD5A2和StAR一抗（稀释度分别为1:4500和1:3000）4°C孵育12小时，随后与辣根过氧化物酶标记二抗孵育，增强化学发光试剂盒显影，凝胶图像分析软件定量并以内参β-actin表达水平归一化。每组随机选取3只大鼠（生物学重复n=3）取左卵巢于液氮中研磨，TRIzol试剂裂解，经氯仿抽提与异丙醇沉淀分离总RNA，评估浓度与纯度后取10 μL总RNA以寡聚（dT）引物和M-MuLV逆转录酶逆转录为cDNA，取1.5 μL cDNA以特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳20–30分钟并以Bio-Rad凝胶成像系统成像，条带强度以Quantity One凝胶分析软件定量。主要结局指标为卵巢SRD5A2与StAR蛋白及mRNA表达水平，次要结局指标包括血清激素浓度（AMH、睾酮、雌二醇、孕酮、LH、FSH）、LH/FSH比值、体重、动情周期规律性及卵巢体积与重量。数据分析采用SPSS 22.0软件，基于既往研究预期大效应量（Cohen's f=0.5）、α=0.05、把握度=0.80，每组至少需10只大鼠，PMOS组采用20只以考虑潜在造模失败。正态分布连续变量以均数±标准差（x?±s）表示，非正态分布数据经对数转换后分析，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）及LSD事后检验，以P<0.05为差异有统计学意义，单因素方差分析效应量以偏eta平方（η2p）报告。研究未设盲，实施分组、DHEA/DMSO注射、阴道细胞学评估及组织采样的研究者知晓分组情况，结局定量（ELISA与蛋白质印迹灰度定量）亦未设盲，可能引入观察者偏倚，尤其在动情周期的主观分期方面。研究结果显示，各组大鼠发育正常，毛发光泽，无异常行为反应，但PMOS组大鼠体重显著高于BC组和DMSO组（P<0.05）；BC组和DMSO组卵巢呈红润健康外观，而PMOS组卵巢苍白，可见多个扩张囊性卵泡，呈双侧不对称增大，各组卵巢体积与重量相当（P>0.05）。阴道细胞学显示BC组和DMSO组动情周期稳定（4–5天，包括动情前期、动情期、动情后期和间情期），而PMOS组全部大鼠（100%，20/20）出现动情周期紊乱，主要表现为动情期延长（60%，12/20）和动情后期延长（40%，8/20），分别延长3–7天和4–6天，且多数周期停滞于动情期或动情后期。血清激素方面，PMOS组血清AMH（F=6.55，P=0.02）、睾酮（F=7.31，P=0.03）和LH（F=7.71，P=0.02）显著高于BC组和DMSO组，而雌二醇、孕酮和FSH水平各组间无显著差异；PMOS组LH/FSH比值显著高于BC组和DMSO组（F=6.94，P=0.04），且DMSO组LH/FSH比值亦显著高于BC组（F=6.94，P=0.04）。蛋白质印迹显示PMOS组卵巢SRD5A2与StAR蛋白水平显著高于BC组和DMSO组（P<0.01）。SRD5A2与StAR mRNA水平在PMOS组卵巢中亦显著高于BC组和DMSO组（均P<0.001）。讨论部分指出，本研究成功建立DHEA诱导的PMOS大鼠模型，以体重增加、卵巢形态异常、动情周期紊乱、血清AMH、睾酮和LH水平升高及LH/FSH比值升高为证据，上述发现与PMOS女性的内分泌代谢特征一致，支持该模型用于研究PMOS发病机制的有效性；然而，尽管DHEA诱导模型重现了PMOS的若干特征，但女性诊断用雄激素为睾酮而DHEA为上游前体，因此上述发现不能直接外推至PMOS女性。SRD5A2是类固醇代谢通路的关键组分，在男性生殖系统中高表达，可将睾酮转化为DHT；肥胖可增强该酶活性。本研究中PMOS组大鼠体重显著高于BC组和DMSO组，提示PMOS大鼠存在肥胖表型；PMOS组卵巢SRD5A2蛋白与mRNA水平显著升高，表明PMOS大鼠卵巢存在SRD5A2过表达；上述发现提示PMOS、SRD5A2表达与体重之间存在关联，但数据不能确立SRD5A2上调由体重增加引起或反之。既往研究报道SRD5A2变异可能降低瘦型女性PMOS风险，但仍需进一步机制研究。本研究中PMOS组血清AMH、睾酮、LH水平及LH/FSH比值显著升高；作为卵巢储备标志物，PMOS大鼠AMH显著升高提示窦卵泡计数增加及卵巢对促性腺激素（尤其LH）的潜在高反应性；睾酮升高反映PMOS大鼠的高雄激素状态，导致月经紊乱与排卵功能障碍；血清LH升高与LH脉冲分泌增强相关，进一步提示排卵功能受损；上述血清激素改变反映了PMOS患者的内分泌特征；但需注意DHT不同于睾酮，不易进入脑内，因此可能不直接参与调控下丘脑LH脉冲性。体外研究显示SRD5A2过表达及其改变可调控类固醇激素合成相关基因表达，从而影响卵泡成熟与激素产生；SRD5A2过表达可抑制HSD17B1表达，而HSD17B1敲除小鼠表现为生育力降低和LH合成受损；PMOS卵巢颗粒细胞中SRD5A2活性升高可显著增强雄烯二酮向5α-雄烷-3,17-二酮的代谢，后者为芳香化酶竞争性抑制剂，阻碍雌激素合成并促进雄激素产生；基于上述结果，研究人员推测SRD5A2过表达启动PMOS的核心病理特征及高雄激素血症并促进LH过度分泌，从而推动疾病进展；然而本研究数据未直接证明SRD5A2表达增加导致高雄激素血症和LH分泌增加，需进一步研究确立因果关系。类固醇生成细胞中的类固醇激素合成与关键酶（P450scc、3β-HSD和17β-HSD）表达水平并不直接相关，而取决于胆固醇从线粒体外膜向内膜转运的效率，该过程受StAR限速；StAR在LH等因子刺激下快速合成，是类固醇激素合成急性期的主要调节蛋白；类固醇生成启动时，垂体来源LH与卵泡膜细胞LH受体结合，促进StAR辅助的胆固醇转运至线粒体内膜，随后经P450scc和3β-HSD催化生成孕酮，再转化为雄烯二酮和雌二醇；据此研究人员假设StAR表达与垂体LH分泌相关；本研究中PMOS组卵巢StAR蛋白与mRNA水平显著高于BC组和DMSO组，与假设及既往发现一致，PMOS组血清睾酮、LH水平及LH/FSH比值显著升高，提示StAR过表达与PMOS大鼠高雄激素血症及LH过度分泌相关，但该关联不能确立因果关系；性腺组织在LH等促性腺激素刺激下StAR蛋白与基因表达增加，因此研究人员提出SRD5A2与StAR可能在促性腺激素影响下于PMOS中相互作用，可能通过基因突变或信号通路（SMAD3）介导，但确切机制尚待阐明。本研究优势包括采用特征明确的DHEA诱导大鼠模型、同时评估蛋白与mRNA水平以及整合激素与分子数据；局限性包括分子分析样本量较小、相关性数据无法确立因果关系、未评估SRD5A1（尽管SRD5A1在人卵巢中占主导）以及啮齿类模型与人类PMOS的固有差异；此外，尽管DHEA诱导模型重现了PMOS若干特征，但女性诊断用雄激素为睾酮，本研究结果对人类PMOS的相关性需谨慎解读。结论部分指出，本研究成功建立DHEA诱导的PMOS大鼠模型，以高雄激素血症、LH/FSH比值升高及动情周期紊乱等PMOS特征为证据；据研究人员所知，本研究首次报道PMOS大鼠卵巢中SRD5A2与StAR蛋白及mRNA水平显著升高；总体而言，上述发现提示SRD5A2过表达可能通过增强睾酮向DHT转化而加重高雄激素血症，StAR过表达可能加速胆固醇向性激素转化并协同促进雄激素合成，两种酶的联合作用可能代表PMOS高雄激素血症与LH过度分泌的关键机制，为PMOS发病机制提供了新证据；临床上SRD5A2与StAR可作为PMOS进一步研究的潜在分子靶点，若未来研究确立因果关系，抑制雄激素转化或调节胆固醇转运理论上可能有助于减少卵巢雄激素产生，但本研究数据不支持对临床管理作出任何改变，仍需进一步人体研究。
