OsASR5-OsAlR3-OsABCI8模块通过增加苹果酸积累与维持ROS稳态增强水稻铝耐受性

《The Crop Journal》：The OsASR5-OsAlR3-OsABCI8 module enhances aluminum tolerance in rice by increasing malate accumulation and maintaining ROS homeostasis

　　

铝毒害限制了酸性土壤中的水稻生产。定位于叶绿体的叶酸受体样蛋白OsAlR3是铝耐受性的关键正调控因子。过表达OsAlR3通过减少Al3+吸收和增强活性氧（ROS）清除能力来提高铝耐受性。研究人员在水稻单倍型之间观察到显著的铝耐受性差异。Hap 2在酸性土壤中占优势（60.2%），而Hap 1在碱性土壤中更为常见（69.3%）。OsAlR3Hap2特异性与ABC转运蛋白OsABCI8相互作用，而OsAlR3Hap1则不能。在铝胁迫下，osabci8敲除突变体表现出根长显著缩短、丙二醛（MDA）含量升高、过氧化物酶（POD）活性降低以及ROS清除能力受损，表明OsABCI8正调控水稻铝耐受性。进一步分析揭示，OsAlR3被OsASR5转录激活，从而有助于水稻铝耐受性。在铝胁迫下，敲除OsAlR3导致多个有机酸代谢相关基因下调。值得注意的是，osalr3、osasr5和osabci8突变体中NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）的表达降低损害了草酰乙酸向苹果酸的转化，导致苹果酸积累减少、Al3+螯合能力减弱以及铝耐受性下降。总之，研究人员的发现揭示了一个新的OsASR5–OsAlR3–OsABCI8调控模块，暗示一种叶酸受体样蛋白参与水稻铝耐受性的调控。

论文解读：OsASR5-OsAlR3-OsABCI8模块通过增加苹果酸积累与维持ROS稳态增强水稻铝耐受性

一、研究背景与研究意义

铝是地壳中含量最丰富的金属元素，约占其质量的7.8%。在正常条件下，铝以非植物毒性的固体形态存在，但当土壤pH值降至5.5以下时，铝被溶解为其三价阳离子形式Al³⁺，对植物产生高度毒性。酸性土壤占全球可耕地的50%以上，全球约有3.95亿公顷，主要分布在北半球的寒温带和南半球的热带地区。在中国，pH低于6.5的土壤覆盖3.1亿公顷，约占全国总土地面积的32.4%，其中南方红壤占60.3%，东北地区占23.3%，其他地区占16.4%。强酸性土壤（pH<5.5）已扩展至1740万公顷且呈增长趋势。人类活动如过量施用铵态氮肥、酸沉降和集约化农业加速了土壤酸化进程。

铝毒害严重抑制植物生长和作物产量，主要原因是必需营养元素如钙、镁和磷的有效性降低，以及锰和铝等金属离子的毒性增加。高活性的Al³⁺可与细胞壁、质膜、细胞骨架和细胞核等多种亚细胞组分结合，破坏其功能，最终抑制根系伸长、阻碍地上部发育并降低作物产量。

减少根细胞中Al³⁺积累是植物应对铝毒害的关键策略，主要通过根尖分泌有机酸螯合根际中的Al³⁺来实现。植物根系释放的最常见有机酸是苹果酸和柠檬酸。此外，铝胁迫诱导植物细胞产生活性氧（ROS）过量生成，造成氧化胁迫。叶绿体ROS是植物响应多种生物和非生物胁迫的关键信号分子。为了清除铝胁迫产生的ROS，植物调节超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和过氧化氢酶（CAT）等酶的活性以及谷胱甘肽（GSH）等非酶抗氧化剂的水平。

尽管在理解外部排斥和内部解毒等生理机制以及识别关键铝响应基因方面取得了显著进展，但铝耐受性是一个由多基因控制的复杂数量性状。因此，鉴定更多的铝响应基因对于阐明铝耐受性的完整分子机制仍然至关重要。本研究旨在揭示OsAlR3的上游转录调控因子及其互作蛋白，阐明OsAlR3、ABC转运蛋白和ROS清除基因之间的调控网络，为培育耐铝水稻品种提供理论基础和基因资源。

二、主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：（1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在耐铝水稻品种昆山杆轴（Kunshanzhuozhou）、日本晴（Sasanishiki）和中花11（ZH11）背景下分别构建了osalr3、osasr5和osabci8敲除突变体；（2）通过农杆菌介导法在水稻中构建了OsAlR3过表达（OE）株系和pOsAlR3::GUS报告株系；（3）采用酵母双杂交（Y2H）和酵母单杂交（Y1H）筛选蛋白质互作和转录因子结合；（4）通过双荧光素酶报告基因检测（DLR）和染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）验证转录调控关系；（5）利用GST pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）实验验证蛋白质物理互作；（6）通过同源建模和结构比对进行蛋白质三维结构预测；（7）利用RiceVarMap v2.0数据库对4709份水稻种质进行单倍型分析。

三、研究结果

3.1 OsAlR3正向调控铝耐受性

研究人员在昆山杆轴（WT）背景下利用CRISPR/Cas9技术生成了osalr3敲除突变体，这些突变体对铝处理更加敏感。随后构建的OsAlR3过表达（OE）株系在铝处理下相对根长、地上部和根部鲜重及干重均显著高于WT。重要的是，OE株系根部的Al³⁺含量比WT降低了44.5%和51.1%，苏木精染色也证实了更少的铝积累。在铝胁迫下，osalr3突变体的丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量显著升高，SOD和POD活性显著降低，而OE株系呈现相反趋势。基因表达分析显示，osalr3突变体中ROS产生基因OsRbohI上调，ROS清除基因OsSODX、OsAPX1和OsCatB下调，OE株系则相反。NBT染色也表明osalr3突变体积累更多ROS。此外，多个铝响应基因包括STAR1、STAR2、ART1、OsCDT3、OsEXPA10和OsFRDL2在osalr3突变体中表达下降，在OE株系中表达上升。这些结果表明OsAlR3通过增强抗氧化防御机制正向调控水稻铝耐受性。

3.2 OsAlR3的表达模式和亚细胞定位

RT-qPCR分析显示，在100 μmol L^-1 AlCl₃处理48小时后，发芽期根部OsAlR3表达量诱导了3.4倍，地上部诱导了1.7倍。OsAlR3转录本在铝暴露后随时间增加，在处理1.5小时达到显著水平，48小时达到峰值。pOsAlR3::GUS转基因植株的组织化学染色显示铝处理显著增强了根和叶中的GUS活性。OsAlR3在整个生育期的不同组织（根、茎、叶）中均有表达。亚细胞定位表明OsAlR3-GFP融合蛋白与叶绿体标记物mCherry-pAD63共定位，证明OsAlR3定位于叶绿体。

3.3 OsAlR3的单倍型分析

利用RiceVarMap 2.0数据库对4709份水稻种质进行分析，鉴定出6个主要单倍型，其中Hap 1和Hap 2最为常见。在2744份籼稻种质中，10.1%携带Hap 1，70.1%携带Hap 2；而在1511份粳稻种质中，97%携带Hap 1，仅2.6%携带Hap 2。在pH<5的区域，Hap 1占33.4%，Hap 2占60.2%；在pH 5-7区域，Hap 1占54.3%，Hap 2占43.4%；在pH>7的区域，Hap 1占69.3%，Hap 2占28.4%。这表明Hap 2可能在酸性土壤中受到正选择。两个关键非同义替换位点（+190 bp和+1085 bp）导致了氨基酸变化（天冬酰胺→天冬氨酸，缬氨酸→甘氨酸），可能是功能差异的基础。

3.4 OsAlR3与OsABCI8相互作用

酵母双杂交实验表明，OsAlR3^Hap2与OsABCI8在酵母AH109细胞中相互作用，而OsAlR3^Hap1则不能。亚细胞定位显示OsABCI8也定位于叶绿体。同源建模和结构比对揭示了两个单倍型间的两个关键非同义替换：在64位，OsAlR3^Hap1编码中性天冬酰胺（Asn64），而OsAlR3^Hap2编码带负电的天冬氨酸（Asp64）；在362位，OsAlR3^Hap1携带庞大的缬氨酸（Val362），而OsAlR3^Hap2携带无侧链的甘氨酸（Gly362）。这些差异可能共同决定了OsAlR3^Hap2与OsABCI8的特异性互作。GST pull-down和Co-IP实验进一步验证了两者的物理互作。在中花11背景下生成的osabci8敲除突变体在铝处理下总根长显著缩短，MDA含量升高，POD活性降低，OsRbohI表达上调和OsSODX表达下调，表明OsABCI8也是铝耐受性的正调控因子。

3.5 OsASR5直接结合OsAlR3启动子并激活其表达

OsAlR3启动子区域包含多个与非生物胁迫响应相关的顺式作用元件，包括GT-1、MYB、ABRE、CGTCA-motif、MYC和STRE元件。酵母单杂交实验显示OsASR5能够结合OsAlR3启动子。ChIP-qPCR分析确认OsASR5特异性结合到OsAlR3启动子的P4区域。双荧光素酶报告基因检测表明，OsASR5与OsAlR3启动子驱动的LUC报告基因共表达导致LUC活性显著升高，证明OsASR5激活OsAlR3启动子。

3.6 OsASR5对水稻铝耐受性至关重要

在日本晴背景下生成的osasr5敲除突变体在铝处理下总根长显著缩短，MDA含量升高，POD活性降低，OsRbohI表达上调和OsSODX表达下调。在正常条件和铝处理下，osasr5突变体中OsAlR3的表达水平均显著低于野生型。这些结果表明OsASR5作为铝耐受性的正调控因子，并且是OsAlR3的上游转录激活因子。

3.7 OsAlR3介导苹果酸分泌

基于osalr3突变体和WT的转录组学和代谢组学数据，研究人员分析了与有机酸代谢相关的差异表达基因（DEG），共鉴定出19个DEG。在osalr3-Al vs. WT-Al比较中，14个DEG下调，包括苹果酸合酶、胞质苹果酸脱氢酶和柠檬酸转运蛋白。三羧酸循环（TCA）通路整合分析显示，编码苹果酸脱氢酶（MDH）的基因在osalr3突变体中下调，而编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）的基因上调。外源苹果酸处理实验表明，向osalr3突变体施加外源苹果酸可显著增加根长、降低Al³⁺含量、提高干重、降低MDA和升高SOD活性。在铝处理下，osalr3突变体的苹果酸含量和NAD-MDH活性显著低于WT，而OE株系则显著高于WT。编码NAD-MDH的基因（OsMDH1、OsMDH1.2、OsMDH10.1、OsMDH12.1）在osalr3突变体中显著下调，在OE株系中上调；而编码PEPCK的Os03g0255500在突变体中上调，在OE株系中下调。此外，在osabci8和osasr5敲除突变体中，OsMDH1.2和OsMDH12的表达在铝胁迫下也显著下调。这些结果表明OsAlR3、OsABCI8和OsASR5协同调控铝胁迫下的苹果酸分泌。

四、讨论与结论

在讨论部分，研究人员首先指出OsAlR3作为叶酸受体样家族成员，通过减少Al³⁺吸收和增强ROS清除能力正向调控水稻铝耐受性。OsAlR3-OE株系根部Al³⁺含量大幅降低，这与铝响应基因的表达模式一致。在osalr3突变体中，过量ROS可能导致ART1降解，损害下游转录，引起铝积累；而在OE株系中，增强的ROS清除能力维持了ART1稳定性，使响应基因快速诱导，减少铝积累。

关于单倍型的地理分布和适应意义，研究人员认为在华南酸性土壤长期选择压力下，携带Hap 2的籼稻品种因赋予更强铝耐受性而被选择性青睐，使其成为与铝耐受性相关的优势单倍型。由于北方粳稻品种大多缺乏Hap 2，该单倍型在改良北方粳稻耐酸性和铝胁迫方面具有巨大潜力。

关于OsABCI8与OsAlR3^Hap2的互作，研究人员通过Y2H、pull-down和Co-IP实验证明了物理互作，并通过结构建模解释了互作特异性的分子基础。osabci8敲除突变体在铝胁迫下ROS清除能力显著降低，与osalr3突变体表型相似，为OsAlR3-OsABCI8互作的生物学相关性提供了有力证据。

关于OsASR5的转录调控，Y1H、DLR和ChIP-qPCR联合实验确认了OsASR5通过结合OsAlR3启动子激活其转录。osasr5突变体在铝胁迫下表型与osalr3突变体一致，证实OsASR5作用于OsAlR3上游。

关于苹果酸含量的调控，外源苹果酸处理有效缓解了osalr3突变体的铝敏感性，而WT因自身已产生足够苹果酸而未受额外影响。osalr3、osabci8和osasr5突变体中NAD-MDH编码基因的下调损害了草酰乙酸向苹果酸的转化，导致苹果酸积累减少，加重了铝损伤。

研究结论： 研究人员提出了一个工作模型，即OsASR5–OsAlR3^Hap2–OsABCI8模块在水稻铝耐受性中发挥核心作用。转录因子OsASR5作为上游调控因子，直接结合OsAlR3启动子并激活其转录。在Hap 2单倍型中，OsAlR3^Hap2蛋白与OsABCI8相互作用形成功能性复合物，协调铝耐受性。一方面，OsAlR3通过上调苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）增强三羧酸循环（TCA）中的苹果酸合成，促进草酰乙酸向苹果酸的转化，增加的苹果酸积累有利于Al³⁺螯合，缓解铝毒害。另一方面，OsAlR3^Hap2和OsABCI8协同调控抗氧化酶基因的表达，清除铝胁迫下过剩的活性氧（ROS），维持细胞氧化还原稳态，从而减轻氧化损伤。