植物顺式调控元件演化：调控组件的重塑与创新

《Current Opinion in Plant Biology》：Rewiring the regulome: Evolution of plant cis-regulatory elements

　　

稳健的基因调控架构对于植物正常发育、环境信号响应及适应性至关重要。受细胞壁造成的技术限制，植物基因调控的理解一直落后于其他生物。然而，分子谱分析技术的创新使得在广泛的植物物种中、跨多样的细胞、发育和环境背景鉴定活跃调控序列变得常规化。尽管取得了这些进展，大多数植物调控元件研究仍集中于单一生物个体内的调控动态性。因此，支配基因调控演化的功能意义和机制规则仍知之甚少。鉴于植物的遗传多样性速率通常远高于后生动物物种，植物模型在解决调控演化中的悬而未决问题方面具有独特优势。本文综述了基因调控演化基本原理的最新进展及其对植物分子、细胞和个体表型的影响。

基因调控是生命之树中细胞和表型多样性的主要来源。尽管动态基因调控的例子贯穿中心法则，但转录起始的控制是最常见且最节能的检查点。转录起始主要由顺式调控元件（CRE）集合的协同活动所支配，CRE是编码序列特异性转录因子（TF）结合位点的短非编码DNA序列基序。CRE活性主要通过核小体——限制大多数TF在非许可细胞背景下接近同源CRE的DNA结合组蛋白八聚体——来许可。因此，基因表达的时空模式源于两个主要调控点之间的相互作用：（i）TF的上下文特异性表达和活性，以及（ii）其同源TF结合位点的核小体占据状态。与高度受限的TF蛋白编码序列相比，非编码CRE对纯化选择的抵抗力显著更强。这种灵活性源于TF结合位点（TFBS）的冗余性、简并性TF结合（TF DNA序列偏好的灵活性）以及与附近其他TF和辅因子的协同相互作用，这些共同缓冲了单个调控变异。然而，越来越多的证据表明，CRE内的遗传变异并非没有后果；调控变异是分子异质性的常见驱动因素，例如通过改变TF结合、核小体占据或转录的速率和输出。这些分子效应反过来经常表现为细胞和个体表型的新颖性。本文综述了过去5-10年顺式调控演化的当代研究，并强调了CRE多样性与植物生物学多个尺度表型创新之间的关系。植物CRE演化由发育约束与适应性调控重塑之间的持续张力所塑造。深时比较分析已在发育调控因子附近鉴定出保守非编码序列（CNS），表明一部分植物调控序列受长期约束所维持。这一保守调控核心嵌入在由突变、结构重排和转座元件（TE）活动不断产生调控新颖性的基因组中。因此，植物CRE演化由多个尺度的遗传变异所驱动。例如，一种更替模式作用于现有CRE内部，其中单核苷酸多态性（SNP）和短插入/缺失（indel）可以创建、增强、减弱或破坏TFBS，允许调控活性分化而不改变已演化元件的位置或剂量。第二种模式通过调控架构的更大变化起作用，因为结构变异（SV），包括缺失、重复、倒位、易位和移动元件插入，可以移除、复制或将CRE重新定位到新的基因组邻域。在番茄和甘蓝型油菜中，群体规模的SV与基因剂量改变、表达变异和农艺性状多样性相关联，说明调控分化可以源于基因组架构以及局部序列变化。泛基因组和图基因组研究进一步表明，这种架构变异未被单一参考分析完全捕获，使得单倍型感知框架对于解释CRE的获得、丢失和重定位至关重要。TE值得单独考虑，因为它们是可移动的重复序列供体，可以改变局部基因组架构，同时提供受表观遗传控制的调控基序。作为插入，它们可以改变调控序列的间距、拷贝数或邻域。作为DNA序列，它们可以携带TFBS、启动子样序列或增强子样模块，可能被宿主调控网络所利用。这种潜力在大植物基因组中尤其重要，其中基因间重复序列经历频繁的扩张和崩溃。然而，TE衍生序列并非自动整合到宿主调控网络中。表观遗传状态和局部染色质背景可以沉默TE衍生序列或允许其被招募到活跃调控景观中。因此，TE衍生序列的演化贡献取决于它们是保持通过内源性沉默机制被抑制还是被利用进入活跃调控染色质。最近的CRE演化研究强调通过染色质可及性、状态和相互作用的变化来理解变异对转录的影响。遗传、表观基因组和报告基因方法现在将调控序列变异与实验测量的分子表型联系起来。除了直接观察TF结合外，染色质可及性是CRE活性的常用读数，将非编码变异与特定基因座的调控活性联系起来。在玉米中，跨214个自交系的批量ATAC-seq鉴定出近40%的可及染色质区域（ACR）在自交系间高度变异。这些ACR还与染色质可及性数量性状基因座（caQTL）显著重叠，包括预测破坏TFBS的变异。跨172个玉米自交系的单细胞水平染色质可及性进一步表明，caQTL效应通常是细胞类型特异性的。作者发现，在TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR（TCP）家族TFBS内精细定位的caQTL对局部和远端染色质可及性具有特别强的效应，而预测降低TCP结合亲和力的等位基因与染色质可及性的急剧下降相关联。这些研究将染色质可及性确立为定量调控表型，通过其CRE序列演化可归因于特定TFBS和细胞类型背景。CRE演化经常涉及调控染色质状态的重塑。转座子和结构改变序列对于理解染色质状态演化特别有信息量，因为它们引入新的调控DNA，可以被表观遗传抑制或整合到活跃染色质中。在玉米中，TE多态性与跨TE类别和基因组背景的局部DNA甲基化差异相关联，长读长染色质分析进一步显示TE衍生序列的子集包含ACR同时保留独特的甲基化特征。在小麦中，TE衍生的增强子样元件提供了直接染色质状态变化的例子，其中一部分通常被抑制的TE在增殖后变得局部低甲基化、可及并与活跃组蛋白标记相关联。MaizeCODE项目通过整合组蛋白修饰、TF占据、增强子样RNA和转录组谱来定义活跃候选CRE（包括远端增强子样序列），将这一原理推广到多样遗传变异，将重要调控区域与驯化相关的染色质状态和表达变化联系起来。因此，CRE演化的分子后果也取决于潜在染色质状态的调控。CRE演化的转录效应还取决于基因组背景和染色质拓扑结构。启动子近端变异可以直接改变启动子可及性、TF招募和RNA Pol II占据，而远端变异可能通过增强子活性和长程染色质接触发挥作用。基于大规模并行报告基因 assay（MPRA）的跨四种植物物种比较揭示了调控增强子活性的功能序列基序，揭示了跨基因组和细胞背景的变异。在玉米中，长程CRE可以作用于最近基因之外，染色质相互作用图谱显示近端-远端接触是动态的，通常与组织特异性表达相关联。植物3D基因组研究进一步表明，染色质组织有助于构建组织、发育阶段和胁迫响应性转录程序的结构。这些研究强调CRE演化的分子后果强烈依赖于基因组、染色质和发育背景。理解CRE活性的细胞背景对于预测其演化至关重要。虽然最初的全组织分析彻底改变了分子谱分析，但这些方法掩盖了稀有细胞类型、瞬态发育状态或特定环境响应中的调控效应。单细胞方法通过将CRE活性分配到定义的细胞背景来解决这一限制。比较单细胞分析将这一框架扩展到调控演化。例如，在C3和C4禾本科植物中，核心C4光合基因附近的ACR显示叶肉或维管束鞘偏好的活性，并包括保守和新演化的元件，表明C4基因座的细胞类型特异性重塑。多物种图谱进一步表明，ACR保守性因细胞背景而异，表皮调控程序在禾本科植物中快速分化。跨多样玉米自交系的群体规模单细胞谱分析将这一演化框架与自然变异联系起来，显示影响染色质可及性、基因表达和个体性状的非编码变异经常以细胞类型特异性方式起作用。因此，单细胞调控遗传学有望增进对CRE保守性、更替和自然变异如何在多样细胞背景中影响调控功能和活性的理解。虽然全基因组方法在理解CRE演化方面变得越来越强大，但聚焦研究继续提供突破。例如，SlWOX2启动子中保守元件的缺失产生部分外显的胚胎致死性以及营养缺陷。类似地，番茄CLV3启动子的遗传扰动产生花序分枝的定量变异，表型效应随CRE保守深度而缩放。这些表型在自然群体中罕见，部分因为致死等位基因被迅速消除，而隐性CRE破坏变异经常被全基因组关联研究（GWAS）遗漏。自然发生的深度保守CRE变异导致严重发育表型的缺失并非巧合。事实上，它反映了在两个时间尺度上运行的相同选择过滤器：（i）跨数亿年保留的CRE是那些其破坏最不被容忍的；（ii）保守CRE优先聚集在胚胎发生、分生组织维持和器官规格的调控因子附近，使其对 proper 生物体发育至关重要，因而对适合度至关重要。在这种观点中，保守性作为发育不可或缺性的读数，系统解剖这类特殊CRE已开始揭示在自然变异中被系统排除的表型维度。虽然急性扰动揭示实验破坏下的CRE功能，但作物驯化提供了互补的历史记录，其中人类选择主要作用于顺式调控变异。过去10,000年玉米驯化说明了这种顺式调控选择模式。例子包括通过改变tb1表达减少腋芽分枝、通过修饰ZmCCT9（一个强效的花期转变抑制因子）表达适应温带气候、通过ZmRAVL1表达变化形成窄直立叶，以及通过可变gt1表达促进顶端优势和花序架构等。类似模式也可在其他植物物种中观察到：番茄果实大小和花序分枝、高粱植株架构和水稻谷粒形态均已追溯到发育主调控因子的顺式调控变异。驯化性状绝大多数由调控而非编码变异解释的反复出现已被认识超过二十年，但直到最近主要基于积累的案例研究而非系统研究。数十年的驯化遗传学现在正通过当代基因组学方法变得常规化。例如，使用群体规模单细胞谱分析，最近一项研究发现483个在玉米与类蜀黍分化后固定的ACR是从TE招募的，表明TE衍生调控变异的选择在玉米驯化中广泛存在。因此，通过转座变异改变基因表达——长期被视为例外——似乎是一个普遍过程。此外，同一研究发现caQTL经常是细胞类型特异性的，富集于TF足迹内，并与玉米对温带气候的适应相关联。总之，携带细胞类型特异性CRE的TE为选择提供了理想底物；基因调控网络及性状可以在一个细胞背景中通过TE增殖被重塑和调节，而不会产生改变主调控因子的多效性成本。虽然发育CRE在强纯化选择下演化，保守古老的调控语法，但胁迫响应性CRE遵循完全不同的模式，其特征在于快速更替、跨谱系的趋同获得和丢失以及环境依赖性适合度效应。揭示深度发育保守性的相同比较框架也显示，胁迫和刺激响应基因在每个可测量尺度上演化最快。从这些分析中出现的基岩与调谐（即保守与可变）架构形式化了这一特征；发育TF附近的深度保守CRE形成受环境选择缓冲的调控骨干，而外围CRE承受气候和胁迫驱动的更替的主要压力，为植物适应提供主要底物。胁迫响应性调控的更快演化速率已在系统发育尺度上被记录。在被子植物的批量表达分析中，环境响应基因在所有功能类别中演化最快。在TFBS水平上，更替速率按TF功能划分。例如，在玉米中，发育调控因子如LATERAL ORGAN BOUNDARY DOMAIN（LBD）、SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE（SPL）和GATA的基序富集于保守ACR内。而环境响应性家族如WRKY和DEHYDRATION RESPONSE ELEMENT BINDING（DREB）的基序则优先耗尽。在科尺度上，只有约50%的基序实例在玉米和水稻之间共享。CRE活性的细胞背景也影响更替速率。在禾本科植物中，表皮和外层程序表现出升高的分化水平，可能由细胞谱系分离和相对于其他细胞类型的直接环境暴露所驱动。在十字花科中，只有约3%的直系同源基因在四个二倍体物种间维持保守的细胞类型表达特异性。跨分类群、尺度和分子层的这种趋同展示了胁迫响应性CRE作为植物调控演化的主要驱动因素。最近，远缘谱系中趋同适应的例子已在直系同源基因座发现特定TF基序的重复获得或丢失。最清晰的案例是在至少七个耐霜冻谱系中重复获得HEAT SHOCK FACTOR（HSF）和GOLDEN2, ARR-B, PSR1（GARP）结合位点，其中HSF因子介导错误折叠蛋白响应以在寒冷期间保护细胞机器。然而信号是有限的，只有约25%的独立冷适应事件表现出HSF/GARP扩张，表明其他基因座、基序家族或机制解释了大多数冷适应。更广泛的比较显示胁迫适应主要是多基因的，许多小TFBS更替事件跨数百个胁迫响应基因，而非单一大效应基因座，是适应的普遍模式。环境响应的多基因性质也可以在更精细尺度上观察到。例如，拟南芥的种内CNS扫描恢复位置可变和存在-缺失CNS富集经典非生物胁迫TF基序，而跨物种分析发现细胞类型特异性胁迫响应的谱系特异性变化经常偏离中性期望。这些发现表明，改善作物环境适应性的努力受到两个不同限制的复杂化。首先，具有保守结合位点的直系同源基因经常显示分化响应，表明单TF基序扫描仅部分捕获适应性变异。剩余变异因此可能嵌入组合TF相互作用、染色质状态或其他分子机制中。其次，过去研究集中于孤立胁迫，历史上将环境响应与发育视为可分离的。实验设计与自然环境不一致，其中胁迫绝大多数是组合性的，并在单细胞内与发育决策整合。因此，未来考虑大量分子测量以及发育与现实世界条件之间相互作用的研究将有利于推进现代作物的环境适应性。下面，研究人员概述植物顺式调控演化有望取得最大进展的六个激动人心的领域。•CRE-基因调控关系在演化中有多稳定？CRE演化通常从调控序列变化推断，但CRE-基因相互作用的变化可能同等重要。大SV可以重新定位CRE或重塑增强子-启动子接触，但这种重定向对调控演化的贡献频率仍不清楚。单倍型解析和跨物种染色质接触图谱以及基于扰动的验证将对解决跨演化背景的CRE-基因配对具有信息量。•CRE分化的因果和预测单元是什么？CRE分化源于SNP、indel、SV或TE，但这些变异的后果通常与其调控单倍型相关联。一个关键挑战是确定新或重排的CRE如何获得活性、哪些被沉默以及哪些需要单倍型水平相互作用。此外，理解使de novo CRE获得上下文特异性活性的机制仍是主要目标。研究人员预计分期泛基因组、单细胞基因组学和组合扰动的结合将有助于解决这些悬而未决的问题。•CRE更替速率的校准？针对中性基线校准更替考虑了谱系特异性背景演化速率，区分选择驱动的调控变化与中性分化。没有这一基线，升高的替换速率可能夸大表观调控更替，而较慢速率可能表明不成比例的约束。早期分化谱系（Physcomitrium、Marchantia）可作为外群来区分调控获得与丢失。•多倍化是调控创新的驱动因素吗？全基因组复制（WGD）聚集在环境剧变周围，表明多倍化本身是一种适应性调控响应。将WGD、SV和TE爆发视为调控变异的主要来源而非结构背景，仍是一个主要概念空白。•利用生态数据建立因果调控适应？粗环境变量是生物实际经历条件的过度简化代理。生态解析的环境数据、群体规模CRE活性谱分析和多基因验证实验为从相关性到因果性提供了有希望的途径。•调控逻辑如何跨组合胁迫和发育整合？特定胁迫组合招募特定TF组装，这种复杂性随环境条件和发育阶段而缩放。这些模式无法从现有单一胁迫数据预测。将组合胁迫因子与发育程序（现在可映射）整合是未来十年的核心任务。