《Current Opinion in Virology》：Advances in experimental model systems to study hepatitis E virus genotype 1
编辑推荐：
戊型肝炎病毒（HEV）是急性肝炎的主要病因之一，据世界卫生组织（WHO）统计，2023年全球约造成2000万例急性戊型肝炎病例。该病毒归类于Hepeviridae科，包含Orthohepevirinae和Parahepevirinae两个亚科。Orthohep
戊型肝炎病毒（HEV）是急性肝炎的主要病因之一，据世界卫生组织（WHO）统计，2023年全球约造成2000万例急性戊型肝炎病例。该病毒归类于Hepeviridae科，包含Orthohepevirinae和Parahepevirinae两个亚科。Orthohepevirinae亚科成员可感染人类及家养和野生哺乳动物（Paslahepevirus属和Rocahepevirus属）、蝙蝠（Chirohepevirus属）和鸟类（Avihepevirus属），而Parahepevirinae亚科成员感染鳟鱼和鲑鱼。Paslahepevirus属在公共卫生关注方面最为重要，目前已鉴定出8种基因型（HEV-1至HEV-8）。HEV-1和HEV-2被认为是人源性基因型。相比之下，HEV-3和HEV-4已在多种动物物种及人类中鉴定，并表现出最大的HEV亚型多样性。HEV-5和HEV-6迄今仅在野猪中报道，而HEV-7和HEV-8主要与骆驼相关。然而，已有HEV-7引起人类感染及HEV-8在食蟹猴中实验性传播的文献记录。HEV-1和HEV-2在许多低收入和中等收入国家呈地方性流行，并与重大水源性暴发相关。HEV-1和HEV-2的主要传播途径是饮用受污染的水，通常发生在强降雨或洪水之后。HEV-1还导致了许多与受污染水源、人道主义危机、过度拥挤和不良卫生条件相关的流行性暴发。此外，已有感染母亲向胎儿或婴儿垂直传播以及输血传播的病例记录。HEV-1主要分布于亚洲和非洲，而HEV-2主要在中美洲和非洲特定地区鉴定。在高收入国家，这些基因型引起的感染通常与国际旅行相关。临床上，HEV-1感染引起以黄疸、发热、恶心、腹痛和肝酶显著升高为特征的急性肝炎。尽管大多数患者经历疾病的自然恢复，但该基因型因其在孕妇（尤其是妊娠晚期）中的高发病率和死亡率而具有特殊的临床相关性。除肝脏受累外，较少见的肝外表现如神经系统疾病、胰腺炎、肾脏受累和血液学并发症也有报道。目前尚无获批的HEV感染抗病毒治疗药物。治疗选择仅限于超说明书使用利巴韦林和聚乙二醇干扰素α（pegIFN-α），两者均具有重要的临床局限性，包括禁忌证和疗效不一。预防选择也有限，Hecolin是唯一获批的HEV疫苗，仅在中国和巴基斯坦获批。体外和体内模型有助于研究病毒复制周期机制、组织嗜性以及参与严重疾病进展的因素。此外，这些模型对于抗病毒治疗、疫苗和预防策略的开发和评估至关重要。然而，HEV-1的研究受到高效且可重复的体外和体内模型缺乏的限制。本综述全面概述了HEV-1细胞培养和动物模型系统的进展与局限性。自HEV（原名肠道传播的非甲非乙型肝炎（ENANB）病毒）被鉴定以来，研究人员为建立HEV-1体外培养系统进行了大量努力。1987年，Pillot等首次报道了体外培养该病毒的尝试，证实了感染患者粪便样本以及接种这些样本的人PLC/PRF/5肝癌细胞培养物中存在ENANB病毒抗原。随后几年，鉴定了多个HEV-1患者来源分离株，包括巴基斯坦株Sar55、中国株87A和摩洛哥株F23。这些分离株随后成为研究动物和体外系统中HEV生物学的重要工具。研究表明多种细胞系对不同HEV-1分离株易感，包括上述PLC/PRF/5细胞、HepG2/C3A细胞（人HepG2肝癌细胞系的亚克隆）、人胚肺成纤维细胞2BS细胞、与感染原代猴肾细胞共培养的恒河猴胚肾细胞系FrhK-4以及人肺癌细胞系A549。此外，已证明HEV-1能够在五种不同的神经元细胞系以及胎盘细胞中复制。然而，这些系统中的病毒复制通常效率低下，往往仅导致有限的病毒增殖，从而限制了其在HEV-1复制周期详细研究中的实用性。由于天然HEV分离株不允许遗传操作，互补DNA（cDNA）克隆的发展代表了该领域的重大进步，为研究HEV-1提供了新机遇。2000年，Panda等从印度HEV暴发期间获得的分离株生成了首批全长cDNA克隆之一，命名为pSGI-HEV(I)。研究人员通过脂质体介导转染将来自该克隆的体外转录病毒RNA导入HepG2细胞，并证明将转染细胞的培养上清经静脉注射入恒河猴可引起HEV感染。随后，Emerson等报道了基于巴基斯坦HEV株Sar55共有序列的cDNA克隆pSK-HEV-2的开发。使用脂质体转染方法将来自pSK-HEV-2的体外转录加帽全长病毒RNA转染入人肝癌细胞系Huh-7和PLC/PRF/5细胞。通过免疫荧光检测到病毒ORF2和ORF3蛋白的表达，证明病毒复制成功。此外，通过用转染的Huh-7和PLC/PRF/5细胞裂解物接种恒河猴，确认了感染性病毒粒子的产生。使用该感染性Sar55 cDNA克隆，比较了多种人和非人细胞系的转染效率。在测试的细胞系中，肝癌来源的PLC/PRF/5和Huh-7细胞以及结直肠腺癌细胞系Caco-2表现出最高的转染效率。然而，转染细胞的比例仍低于15%。PLC/PRF/5、Huh-7、HepG2/C3A、Caco-2和A549细胞被含于人粪便悬液中的Sar55感染，但仅在HepG2/3CA细胞中报道了大量感染细胞。为至少允许分析病毒复制，Emerson等在2004年开发了基于报告基因的HEV-1复制子系统，其中ORF2和ORF3编码区被绿色荧光蛋白（GFP）或萤火虫荧光素酶序列替换，使得能够在细胞培养中定量监测病毒复制。为改善HEV-1株的体外增殖，研究人员研究了多个允许性细胞系的亚克隆。Huh-7来源的亚克隆S10-3与其他Huh-7亚克隆相比，对含于人粪便悬液中的Sar55表现出增强的转染性和感染性。同一研究组还分离了Caco-2来源的亚克隆C25j，其转染效率显著提高至约30%。此外，转染后感染性病毒的产生随时间增加，通过HepG2/C3A细胞滴定确定，转染后8天培养上清中滴度达到8.7×103感染性病毒粒子/mL。相比之下，亲本Caco-2细胞的转染效率为5%，感染性病毒产生在转染后11天达到最大滴度1×103感染性病毒粒子/mL。然而，未研究Caco-2或C25j细胞的感染，且未在其他地方检测用培养上清中的Sar55感染HepG2/C3A细胞。除鉴定更允许的HEV-1培养细胞系外，通过连续传代使病毒适应细胞培养条件代表了一种互补策略，有助于出现和选择赋予增强复制适应性的突变。该方法成功应用于HEV-3分离株Kernow-C1/P1，其在HepG2/C3A细胞中连续传代六次后获得增强的复制适应性，主要由于人核糖体蛋白S17编码序列片段插入高变区（HVR）。相同的S17插入被实验性引入HEV-1株Sar55的HVR，与缺乏插入的亲本病毒相比，复制效率略有增加。一项在细胞培养中增殖HEV-1的尝试表明，来自患者血清的病毒可感染PLC/PRF/5和A549细胞，且HEV RNA在传代至相同细胞系后仍可检测到。2023年，Primadharsini等通过在原代A549_1-1H8细胞（A549的亚克隆）中连续传代12次，使最初从印度患者分离的HEV-1株JE04-1601S适应了细胞培养。第十次传代后，培养上清中病毒RNA达到峰值水平的时间缩短，峰值水平增至约10?拷贝/mL，而第一次传代为6.9×10?拷贝/mL。此外，研究人员基于适应病毒构建了全长cDNA克隆（命名为p12），在PLC/PRF/5细胞中转染后滴度达到10?拷贝/mL，从而为HEV-1研究提供了改进的实验系统。同年，Bai等基于不同的HEV-1株生成了另一个cDNA克隆，并证明在转染或感染PLC/PRF/5细胞后有效复制，孵育3-4周后培养上清中滴度超过10?拷贝/mL。一年后，研究人员系统评估了Huh-7来源的Huh7-Lunet BLR、PLC/PRF/5和Caco-2细胞在转染后产生Sar55以及感染病毒粒子后支持复制的能力。在测试的细胞系中，Caco-2在转染后培养上清中表现出最高的基因组拷贝数。当用转染细胞的培养上清接种 na?ve 细胞时，仅Caco-2细胞被有效感染。通过Caco-2细胞滴定确定，转染后14天收集的Caco-2培养上清含有103-10?感染性Sar55粒子/mL。转染或感染后，Caco-2细胞支持Sar55持续复制，其水平超过HEV-3参考株47832分子克隆所观察到的水平。在过去十年中，更具生理相关性的模型系统已可供使用，包括原代细胞培养和干细胞来源的模型。2018年，研究表明从感染猕猴粪便中分离的Sar55株的完整复制周期可在体外由诱导多能干细胞（iPSC）来源的肝细胞支持。最近，HEV-1感染也在干细胞来源的肝类器官中得到证明，其中约30%的白蛋白阳性肝细胞样细胞对ORF2衣壳蛋白呈阳性。值得注意的是，感染类器官的上清能够启动二次感染，表明在该模型中完成了完整的病毒复制周期。HEV-1的允许性也在干细胞来源的肠道和脑类器官中得到证明，利巴韦林在这些系统中减少了感染。与这些发现一致，另一项近期研究表明人多能干细胞来源的肠道类器官对来自患者粪便样本的HEV-1易感。鉴于HEV-1在妊娠期间构成的重大风险，多项研究采用先进的体外共培养系统和离体组织模型来研究其在母胎界面的致病性和垂直传播的潜在机制。例如，在包含原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人胎盘滋养层细胞系BeWo的共培养系统中，研究表明尽管HEV-1在感染后四天内无法穿越体外母胎屏障，但病毒引发了以III型干扰素和趋化因子CXCL10诱导为特征的局部抗病毒免疫应答。在一项利用移植的母体蜕膜和胎儿胎盘组织的补充离体研究中，HEV-1和HEV-3之间的比较分析显示，患者来源的HEV-1分离株不仅产生显著更高水平的感染性病毒粒子，而且诱导更明显的组织损伤。这表现为母胎界面结构完整性和细胞架构受损，该现象在该模型中仅在HEV-3感染中极少观察到。这些生理相关模型改善了HEV-1生物学研究，但它们仍缺乏系统性免疫、内分泌、血管和器官间复杂性。此外，使用原代人肝细胞的基于肝脏的HEV-1研究仍然稀少，许多系统转而依赖iPSC来源的肝细胞样细胞或类器官，这些可能不能完全反映成人肝细胞生理学。总体而言，属于不同亚型的不同HEV-1株的细胞培养和反向遗传学系统已存在，通过使研究株/亚型特异性差异以及与其他基因型的比较研究成为可能，为基础和应用HEV研究提供了宝贵工具。然而，HEV-1培养系统仍受限于低复制效率、有限的细胞允许性以及缺乏稳健、可重复的高滴度病毒生产系统。因此，未来研究应旨在使用基于组学和遗传筛选方法鉴定HEV-1允许性和复制效率的决定因素，同时在标准化培养条件下跨不同细胞背景系统比较不同HEV-1株。此外，未来工作应扩大患者来源HEV-1分离株的使用，区分病毒RNA检测与感染性粒子产生，并评估准包膜和非包膜粒子在感染性和细胞嗜性方面的差异。这些方法对于提高HEV-1培养系统的稳健性和可比性以及更好地定义病毒复制和宿主-病毒相互作用中的株特异性差异至关重要。体外平台在分子水平上对理解病毒-宿主相互作用做出了重大贡献。然而，它们未能重现HEV-1感染的复杂病理过程，而体内模型可以提供更完整的生理和免疫背景。尽管HEV-1不被认为是人畜共患的，自然仅感染人类，但实验感染已在几种已建立的动物模型中得到证明。非人灵长类（NHPs）在HEV发现和早期研究中发挥了重要作用。1983年，Balayan首次观察到ENANB粒子并成功在食蟹猴中传代HEV。随后研究证实了恒河猴、黑猩猩和其他NHPs的易感性。在这些动物中实验性感染HEV-1重现了人类急性病毒性肝炎的关键特征，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高、病毒血症和粪便排毒。尽管NHPs不是HEV的自然宿主，但它们代表与人类最密切相关的动物模型，并对多种HEV基因型表现出易感性，使其在HEV致病性、跨物种传播以及疫苗和抗病毒治疗的临床前评估研究中不可替代。然而，高成本和伦理问题限制了它们作为常规研究平台的应用，推动了更经济、更易获得的小动物模型的发展。尽管无法完全重现人类感染，小动物模型具有成本较低、操作更容易和通量更高等优势，从而有效补充NHPs。目前建立的HEV-1小动物模型主要包括人源肝脏嵌合小鼠和蒙古沙鼠。人源肝脏嵌合小鼠成为首个HEV-1小动物模型。这些小鼠通过将原代人肝细胞移植到患有肝损伤的严重免疫缺陷小鼠肝实质中而产生。2016年，Allweiss等首次通过静脉注射患者粪便悬液在人源肝脏嵌合尿激酶型纤溶酶原激活物-重症联合免疫缺陷（uPA-SCID）beige（USB）小鼠中建立HEV-1感染。小鼠出现快速病毒血症，并检测到粪便排毒。随后使用人源肝脏嵌合uPA-SCID、FAH-/--Rag-2-/--IL-2Rγ-/-（FRG）和uPA-NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull（NOG）小鼠的研究证实了这些发现，并验证了利巴韦林和pegIFN-α的疗效。此外，使用细胞培养来源的HEV-3病毒粒子感染这些小鼠已确认病毒感染性，为研究HEV分子生物学提供了有效的体内平台。尽管具有吸引力，但该模型存在局限性：人源肝脏嵌合小鼠的生成成本高昂且技术难度大，且人嵌合程度在慢性感染期间可能下降。此外，严重免疫缺陷背景不仅使这些小鼠中的HEV感染呈慢性病程而非免疫正常人类中观察到的急性自限性肝炎，而且排除了对适应性免疫应答和疫苗效力的研究。未来努力应集中于免疫重建或建立免疫正常的HEV模型，因为共移植人免疫系统和人肝癌细胞的人源化小鼠模型已用于HBV和HCV研究。蒙古沙鼠已成为一种有前景的免疫正常模型。2009年首次证明其对HEV-4易感，随后研究证明对HEV-1、HEV-3、HEV-4、HEV-5和HEV-C1易感。2024年，Liu等首次通过在老年雄性沙鼠中连续传代临床分离株建立了稳定的HEV-1感染，获得了一种在成年沙鼠中引起急性感染的适应株，表现为持续的粪便排毒、病毒血症、多个组织中HEV RNA/抗原检测、组织病理学肝损伤、血清ALT水平升高和抗HEV抗体血清转换。沙鼠模型也已用于抗病毒（利巴韦林、pegIFN-α）和疫苗（Hecolin）评估。值得注意的是，感染HEV-1的妊娠晚期沙鼠表现出高孕产妇死亡率、垂直传播和不良妊娠结局，与人类疾病密切相似。蒙古沙鼠模型提供了免疫正常、低成本且高度可操作的体内平台，但与小鼠相比，其基因编辑系统的可及性仍不发达，且缺乏物种特异性试剂（如商业抗体和检测试剂盒）。未来研究应侧重于标准化感染方案，并使用沙鼠妊娠模型探索激素变化、免疫应答、胎盘屏障功能与HEV-1感染相关高死亡率之间的相互作用，尤其是在南亚地区。最近，三种野生啮齿动物，即Apodemus peninsulae、Clethrionomys rufocanus和Lasiopodomys brandtii，被证明对HEV-1实验性感染易感。感染动物表现出粪便排毒、全身性病毒复制、血清转换、轻度肝脏病变和免疫激活证据。总之，这些特征表明这些啮齿动物物种满足作为研究HEV-1感染实验模型的几个重要先决条件，并可能有助于更好地理解人类感染。总之，HEV-1的早期研究严重依赖NHPs，其具有金标准地位但受高成本和伦理问题限制。人源肝脏嵌合小鼠解决了HEV-1小动物模型长期缺乏的问题。然而，其免疫缺陷背景和有限的可及性仍是主要制约因素。随后，免疫正常的沙鼠模型重现了急性感染和妊娠死亡率，但面临技术不成熟的问题。未来研究应进一步优化现有模型、标准化感染方案、研究更多HEV-1亚型、探索妊娠死亡机制并鉴定新的有前景的动物模型。尽管经过数十年的努力，HEV-1缺乏稳健的细胞培养系统仍是该领域的主要限制。与HEV-3可用的系统相比，HEV-1在体外通常产生显著较低的病毒滴度，限制了当前模型解决HEV-1生物学基本问题的实用性。为改善HEV-1模型，进一步努力应集中于优化细胞培养条件、增强转染方法、通过CRISPR工程改造对HEV-1复制关键的宿主因子以及开发更允许的细胞系以最大化病毒产量。除体外方法外，体内模型对HEV-1研究不可或缺。历史上，HEV动物模型主要限于非人灵长类，出于伦理和成本原因并非最优。最近，小动物模型（包括人源肝脏嵌合小鼠和沙鼠）已被引入，为研究HEV-1感染提供了额外机会。然而，能够捕捉口服传播和妊娠相关疾病的免疫正常系统仍然受限。
研究人员系统综述了戊型肝炎病毒基因1型（HEV-1）实验模型系统的研究进展。HEV-1在传播途径、流行病学和临床结局方面与其他HEV基因型存在显著差异，是导致低收入和中等收入国家水源性暴发及孕妇高死亡率的重要病原体。然而，相较于HEV-3，HEV-1长期缺乏高效、可重复的体外和体内模型系统，严重制约了对其复制周期机制、组织嗜性、致病机制以及抗病毒药物和疫苗评价的研究。为此，研究人员对HEV-1细胞培养系统和动物模型系统的进展与局限性进行了全面梳理。在体外模型方面，从早期PLC/PRF/5、HepG2/C3A、A549等细胞系的初步尝试，到cDNA感染性克隆（如pSGI-HEV(I)、pSK-HEV-2）和报告基因复制子的建立，再到细胞亚克隆（S10-3、C25j）、病毒连续传代适应（JE04-1601S_p12）以及iPSC来源肝细胞、肝/肠/脑类器官和母胎界面共培养/离体组织模型的发展，HEV-1体外系统经历了从低效到逐步优化的演进。在体内模型方面，非人灵长类（NHPs）作为金标准模型可重现人类急性肝炎特征但受成本和伦理限制；人源肝脏嵌合小鼠（uPA-SCID、FRG、NOG）首次提供了小动物模型但存在免疫缺陷和嵌合度下降等问题；蒙古沙鼠作为免疫正常模型可重现急性感染、垂直传播和妊娠高死亡率，但基因编辑工具和物种特异性试剂匮乏；此外，三种野生啮齿动物也被证明对HEV-1实验性感染易感。研究结论指出，尽管数十年努力，HEV-1稳健细胞培养系统的缺乏仍是该领域主要限制，未来应聚焦于优化培养条件、增强转染方法、利用CRISPR工程改造宿主因子、开发更允许的细胞系，并进一步优化和标准化体内模型、研究更多HEV-1亚型及妊娠死亡机制。该综述为HEV-1研究模型的选择和未来发展方向提供了系统参考，对推动HEV-1基础研究和转化应用具有重要意义。研究人员为开展本综述，主要采用文献综述方法，系统检索和分析了HEV-1体外细胞培养模型（包括多种细胞系、cDNA克隆、复制子系统、细胞亚克隆、病毒传代适应株、干细胞来源肝细胞和类器官、母胎界面共培养及离体组织模型）和体内动物模型（包括非人灵长类、人源肝脏嵌合小鼠、蒙古沙鼠及野生啮齿动物）的相关研究文献，并对各模型的建立方法、应用范围、优势与局限性进行了比较分析。研究结果方面，第一，在HEV-1体外模型系统方面，通过梳理从1987年首次体外培养尝试到2024年Caco-2细胞系统评估的研究历程，得出HEV-1体外培养系统虽已从多种细胞系初步尝试发展到cDNA克隆、复制子、细胞亚克隆和病毒适应株等多层次工具，但仍受限于低复制效率、有限细胞允许性和缺乏稳健高滴度生产系统的结论。第二，在cDNA感染性克隆与反向遗传学系统方面，通过分析pSGI-HEV(I)、pSK-HEV-2、p12及Bai等构建的克隆，得出cDNA克隆为HEV-1遗传操作和复制机制研究提供了关键工具，但转染效率和病毒产量仍需提升的结论。第三，在细胞亚克隆与病毒传代适应方面，通过分析S10-3、C25j亚克隆和JE04-1601S_p12适应株，得出细胞亚克隆和连续传代可显著提高转染效率和病毒滴度，是改善HEV-1体外系统的有效策略的结论。第四，在生理相关体外模型方面，通过分析iPSC来源肝细胞、肝/肠/脑类器官及母胎界面模型，得出这些模型可支持HEV-1完整复制周期并揭示妊娠相关致病机制，但仍缺乏系统免疫和器官间复杂性的结论。第五，在HEV-1体内模型方面，通过分析NHPs、人源肝脏嵌合小鼠、蒙古沙鼠和野生啮齿动物，得出NHPs为金标准但受限，人源肝脏嵌合小鼠填补了小动物模型空白但免疫缺陷，蒙古沙鼠为免疫正常模型可重现急性感染和妊娠死亡率但技术不成熟，野生啮齿动物显示易感性但需进一步验证的结论。讨论部分总结指出，HEV-1模型系统的核心矛盾在于体外复制效率低下和体内免疫正常模型匮乏。未来方向包括：利用组学和遗传筛选鉴定HEV-1允许性和复制效率决定因素；标准化培养条件下跨细胞背景比较不同HEV-1株；扩大患者来源分离株使用；区分病毒RNA检测与感染性粒子产生；评估准包膜与非包膜粒子差异；优化体内模型、标准化感染方案、研究更多亚型及妊娠死亡机制。研究结论翻译如下：尽管经过数十年的努力，HEV-1缺乏稳健的细胞培养系统仍是该领域的主要限制。与HEV-3可用的系统相比，HEV-1在体外通常产生显著较低的病毒滴度，限制了当前模型解决HEV-1生物学基本问题的实用性。为改善HEV-1模型，进一步努力应集中于优化细胞培养条件、增强转染方法、通过CRISPR工程改造对HEV-1复制关键的宿主因子以及开发更允许的细胞系以最大化病毒产量。除体外方法外，体内模型对HEV-1研究不可或缺。历史上，HEV动物模型主要限于非人灵长类，出于伦理和成本原因并非最优。最近，小动物模型（包括人源肝脏嵌合小鼠和沙鼠）已被引入，为研究HEV-1感染提供了额外机会。然而，能够捕捉口服传播和妊娠相关疾病的免疫正常系统仍然受限。
