四种鲨鱼主要组织相容性复合体II类基因的遗传多样性研究

《Developmental & Comparative Immunology》：Insights Into the Genetic Diversity of Major Histocompatibility Complex Class II Genes in Four Shark Species

　　• 对四种鲨鱼物种的MHC多样性进行了初步表征。• MHC II类α和β显示出1-3个假定的拷贝数，与其他软骨鱼类一致。• MHC多态性等于或超过了相关鲨鱼的微卫星多样性。• MHC II类α和β中的几个PBR密码子显示出多样化选择的证据。

引言
近年来，野生动物管理者越来越关注由于气候变化导致自然种群遗传多样性丧失的问题（Frankham等人，2019年；Leigh等人，2019年）。遗传多样性对于种群存活以及物种健康和持久性非常重要（Hughes和Stachowicz，2004年）。由于大多数野生种群栖息地多变，高遗传多样性增加了携带适应环境变化等位基因的可能性（Frankham等人，2010年）。多样性可能通过生态和人口统计过程丧失，包括过度捕捞和栖息地丧失等压力造成的种群瓶颈（Exposito-Alonso等人，2022年；Sadler等人，2023年）。这种丧失增加了近亲繁殖衰退和感染易感性的风险（Kardos等人，2021年），因此在人为气候变化下进行有效管理需要能够捕捉可能与环境和选择压力相关的功能变异的遗传工具。

遗传变异的谱系地理模式通常使用线粒体和核DNA中的中性（非编码）标记来量化，这有助于理解由基因流和遗传漂变共同作用引起的时空进化结构差异（Dudgeon等人，2012年；Holderegger等人，2006年）。但是在功能基因上测量多样性可以提供有关种群如何进化并适应过去环境压力以及它们如何应对当前变化的见解，这些是中性标记无法解决的（Holderegger等人2006年；Allendorf, Hohenlohe和Luikart 2010年；Piertney和Webster 2010年）。然而，在非模式生物（如鲨鱼）中开发针对功能标记的引物相比在模式生物或具有高度注释参考基因组的生物中要少得多。

作为一个已作为功能遗传标记使用过的基因区域是主要组织相容性复合体（MHC）（Manlik等人，2019年；Sommer，2005年；Ujvari和Belov，2011年），它集中了免疫基因，包括那些编码能够识别并将来自感染因子的抗原呈递给T细胞的蛋白质的基因，以激活适应性免疫系统（AIS）（Dooley，2018年；Penn和Ilmonen，2005年；Potts和Wakeland，1990年）。由于MHC基因的高多样性与其对抗多种病原体的能力相关，这些位点是基因组中最易变的（某些人类MHC基因有超过1,300个等位基因），并且是许多生物群体中自然选择和性选择的已知目标（Hughes和Yeager，1998年；Kasahara等人，1993年；Klein，1986年）。经典的MHC I类和II类基因的大部分变异集中在肽结合区（PBR或抗原结合位点）。随着时间的推移积累的遗传变异导致多种MHC变异体，这些变异体可以结合不同的病原体衍生肽，这种变异被认为是通过宿主-病原体共同进化而来的（Flajnik和Kasahara，2001年；Hughes和Yeager，1998年；Kelley等人，2005年；Penn和Ilmonen，2005年）。预计这种进化军备竞赛将通过平衡选择来保持多样性，从而促进种群中包括稀有等位基因在内的多种等位基因的维持（Borghans等人，2004年；Smith等人，2014年）。

现代有颌脊椎动物的祖先是最早进化出适应性免疫系统基因的生物（Flajnik和Kasahara，2010年；Veríssimo等人，2023年）。在细胞水平上区分自身与非自身的能力（同配性）对于胎盘胎生或活产也很重要，这一特征最早出现在祖先鲨鱼中。鲨鱼的MHC基因包含许多在脊椎动物中保守的特征（Bartl，1998年），其中包括PBR处的高度多态性核苷酸段。据认为，与其他脊椎动物相比（例如慈鲷中有17个MHC基因拷贝），鲨鱼每个MHC基因只有1-2个祖先“原型”拷贝（Simona, Bartl和Weissman，1994年；Kasahara等人，1993年；Málaga-Trillo等人，1998年；Okamura等人，1997年；Veríssimo等人，2023年）。虽然护士鲨（Ginglymostoma cirratum）被用作研究AIS进化的模型以洞察人类生物医学，但关于大多数鲨鱼的MHC结构和多样性的了解仍然很少。因此，在多个软骨鱼类谱系中表征这些特征对于理解MHC多样性如何在软骨鱼类中进化非常重要。

目前发表的鲨鱼参考基因组相对较少，由于相隔超过1000万年进化的物种之间的基因组差异很大，新物种中的MHC位点定位变得困难。因此，只有八种软骨鱼类直接分离并测序了MHC基因：白斑竹鲨（Chiloscyllium plagiosum）（Ma等人，2013年）、护士鲨（Ginglymostoma cirratum）（Bartl，2001年；Simona Bartl和Weissman，1994年；Ohta等人，2002年）、带纹犬鲨（Triakis scyllium）（Ohta等人，2000年）、斑点猫鲨（Scyliorhinus canicula）（Gaigher等人，2023年；Yang等人，1997年）、小鳐鱼（Leucoraja erinacea）（Smith等人，2014年）、刺狗鱼（Squalus acanthias）（Wang等人，2003年）、角鲨（Heterodontus francisci）（Bartl等人，1997年）和蓝鲨（Prionace glauca）（McMillan，2013年）。在具有多个MHC拷贝证据的物种中，包括护士鲨（Kasahara等人，1993年）、白斑竹鲨（Ma等人，2013年）和小斑点猫鲨（Gaigher等人，2023年），拷贝数在不同物种之间存在差异，而蓝鲨没有多个MHC II类拷贝的证据（McMillan，2013年）。此外，在同一物种的不同个体之间也观察到了MHC II类α（Kasahara等人，1993年）和β（Ma等人，2013年；Rota等人，2025年）基因的拷贝数变异。

到目前为止，MHC已被用作鸟类（Vásquez-Carrillo等人，2014年）、爬行动物（Elbers和Taylor，2016年；Miller等人，2008年）、两栖动物（Belasen等人，2019年；Savage等人，2018年）、鱼类（Bracamonte等人，2015年；Cohen，2000年；Dionne等人，2007年；Eizaguirre和Lenz，2010年；Faulks和?stman，2016年；Ratcliffe等人，2022年）和哺乳动物（Hedrick等人，2003年；Manlik等人，2019年；Smith等人，2010年）等不同分类单元中的功能标记。在淡水和海水鱼类中，MHC基因是环境驱动定向选择的目标（Bernatchez和Landry，2003年；Dearborn等人，2022年；Dionne等人，2007年；Flajnik和Kasahara，2001年）。例如，波罗的海的本地鲈鱼（Perca fluviatilis）表现出比已知易感染病毒的引入澳大利亚种群更高的遗传多样性（Faulks和?stman，2016年）。但是许多应用MHC基因的研究依赖于先前的基因组资源，包括详细的基因表征、特定物种的引物开发，在某些情况下还需要高度注释的参考基因组。然而，这些资源对于软骨鱼类来说极其有限，而且现有的少数MHC序列来自进化上疏远的鲨鱼，这限制了它们在其他缺乏可比基因组信息的谱系中的实用性。因此，扩展软骨鱼类中MHC的分类学表示对于了解物种间的多样性程度和组织结构以及为未来的功能遗传学研究建立框架非常重要。

作为早期分化的有颌脊椎动物谱系，鲨鱼为理解AIS多样性的进化提供了一个重要的比较框架。因此，鲨鱼的免疫遗传多样性可以提供关于塑造参与病原体识别和宿主防御的免疫基因的进化力量的见解，以及这种变异对自然种群适应性的潜在贡献。MHC基因的极端多态性使它们特别适合研究这些过程，因为序列变异模式可用于评估自然选择的特征，并检查免疫基因多样性在不同有颌脊椎动物中的进化情况。我们的目标是通过开发引物从PBR中分离MHC序列变异体，来表征缺乏特定物种注释参考基因组或MHC数据的鲨鱼物种中的MHC II类多样性和拷贝数。在这里，我们提供了四种分类学上不同的鲨鱼物种的MHC拷贝数和多样性的初步表征。我们将这些结果与相同或相关物种的微卫星DNA位点的多样性估计进行了比较。

**数据提取和扩增**
我们使用了之前收集的四种鲨鱼的肌肉或鳍组织：沿海-远洋虎鲨（Galeocerdo cuvier；Carcharhiniformes目，α n = 15，β n = 13）、深水古巴狗鱼鲨（Squalus cubensis；Squaliformes目，α n = 18，β n = 17）、深水Genie’s狗鱼鲨（Squalus clarkae；Squaliformes目，α n = 12，β n = 12）以及浅海大西洋尖鼻鲨（Rhizoprionodon terraenovae；Carcharhiniformes目，α n = 15，β n = 12）。

**基因拷贝数**
由于没有可用的特定物种参考基因组，我们无法确定每个个体中存在的MHC基因拷贝数。因此，我们使用了从Sanger数据中恢复的唯一序列变体数量来表征潜在的拷贝数。MHC II类α和β的克隆表明，在四个研究物种中的三个物种中存在两个或更多的假定基因拷贝（表2），每个物种的假定拷贝数范围为...

**讨论**
在本研究中，我们分析了四种以前未研究过的鲨鱼物种的MHC II类α和β多样性，从而增加了现在可以进行扩增的鲨鱼物种的数量。本研究中获得的MHC序列变异在核苷酸和氨基酸水平上与Almeida等人发布的有限特定物种MHC序列（图S1-S4）以及可用的注释参考基因组相似。我们之间的序列变异差异...

**作者贡献声明**
Toby S. Daly-Engel：写作 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念化。
Michael F. Criscitiello：写作 – 审稿与编辑、监督、项目管理、概念化。
Eloise J. Cave：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、项目管理、方法学、调查、资金获取、正式分析。

**未引用参考文献**
Bartl和Weissman，1994年；Bartl和Weissman，1994年。

**伦理声明**
本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：机构动物护理和使用委员会。该研究获得了机构动物护理和使用委员会的批准（批准号2018-07）。

**数据可访问性**
本手稿中描述的DNA序列将存档在National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank中。

**伦理和许可批准**
所有研究都在IACUC批准2018-07的指导下进行。组织样本收集是由合作者根据他们所在州的收集许可进行的。

**资助**
本工作得到了Save Our Seas基金会的小额资助、美国软骨鱼类学会研究资助和PADI基金会研究资助的支持。

**利益冲突声明**
作者没有需要披露的相关利益冲突。

**致谢**
我们感谢Manav Agarwal、Kieran Stein以及佛罗里达理工学院的Shark Conservation Lab的所有成员提供的帮助和支持。我们也感谢德克萨斯A&M大学Comparative Immunogenetics Lab的所有成员的指导。这项研究得到了Save Our Seas基金会的小额资助、PADI基金会研究资助、美国软骨鱼类学会学生研究资助以及Ocean Engineering的支持。

**作者名单**
Eloise J. Cave | Michael F. Criscitiello | Toby S. Daly-Engel