《European Journal of Cancer》：Novel adenoma-immune phenotypes are associated with risk of metachronous polyps and colorectal cancer in a bowel screening cohort
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大约30-40%接受筛查性结肠镜检查的个体存在癌前结直肠息肉，其中大多数为传统腺瘤。内镜下息肉切除术可预防未来恶性转化；然而，患者仍面临发展为进一步息肉和/或结直肠癌（CRC）的风险增加。目前的息肉切除术后监测方案依赖于宽泛参数，包括指数操作时的息肉大小、数量
大约30-40%接受筛查性结肠镜检查的个体存在癌前结直肠息肉，其中大多数为传统腺瘤。内镜下息肉切除术可预防未来恶性转化；然而，患者仍面临发展为进一步息肉和/或结直肠癌（CRC）的风险增加。目前的息肉切除术后监测方案依赖于宽泛参数，包括指数操作时的息肉大小、数量和异型增生。然而，综合技术改进息肉监测（INCISE）协作项目的数据表明，这些参数通常导致风险预测欠佳，约40%被认定为高风险者无后续息肉，而47%被认定为低风险者发现后续病变。因此，有必要开发新的生物标志物，以更精确地根据异时性病变风险对患者进行分层，同时提供对结直肠癌病因学的更深层次见解并突出潜在干预途径。腺瘤内及结肠黏膜的免疫环境可能影响未来息肉和癌症风险。新兴证据表明，免疫排斥——特别是有益的抗癌适应性免疫和细胞毒性效应反应的排斥——允许腺瘤进展为癌症。在筛查发现的腺瘤组织中，研究人员及其他团队已报道免疫浸润（特别是T细胞亚群）与晚期腺瘤相关组织病理学特征（包括大小、异型增生和绒毛状结构）之间的关系。本研究旨在通过整合大型高度注释队列中的综合人口统计学、暴露、临床和病理数据，确定腺瘤的免疫架构和/或特定免疫特征是否与指数肠道筛查结肠镜检查后6年内异时性息肉或CRC的发生相关。
**研究背景与问题**
结直肠息肉中传统腺瘤最为常见，是未来息肉和结直肠癌（CRC）的关键风险因素。内镜下息肉切除术可预防恶性转化，但患者仍面临异时性病变风险。当前息肉切除术后监测方案主要依据指数操作时的息肉大小、数量和异型增生等宽泛参数进行风险分层。然而，INCISE协作项目数据显示，这些参数对风险的预测欠佳：约40%被认定为高风险的患者后续未发现息肉，而47%被认定为低风险的患者却发现了后续病变。因此，有必要开发能更精确分层异时性病变风险的新型生物标志物，同时深化对结直肠癌病因学的理解并揭示潜在干预途径。腺瘤内及结肠黏膜的免疫微环境可能影响未来息肉和癌症风险，新兴证据表明免疫排斥（尤其对有益的抗癌适应性免疫和细胞毒性效应反应的排斥）允许腺瘤进展为癌症。研究人员此前已报道筛查发现的腺瘤组织中免疫浸润（特别是T细胞亚群）与晚期腺瘤组织病理学特征（包括大小、异型增生和绒毛状结构）之间存在关联。本研究旨在通过整合大型高度注释队列的综合人口统计学、暴露、临床和病理数据，确定腺瘤的免疫架构和/或特定免疫特征是否与指数肠道筛查结肠镜检查后6年内异时性息肉或CRC的发生相关。
**关键技术方法**
研究基于INCISE队列，纳入2642例来自NHS Greater Glasgow and Clyde（2009-2016）的肠道筛查患者，所有患者均接受结肠镜下息肉切除术并在术后6个月至6年内接受至少一次监测性结肠镜检查，主要结局为该期间异时性息肉或CRC的发生。排除锯齿状谱系病变、CRC、CRC病史、息肉病或CRC易感综合征、炎症性肠病及系统性血管炎患者。采用4 μm厚全切片福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）腺瘤和2.5 μm厚腺瘤组织微阵列（TMA）进行分析。免疫组化（IHC）检测CD3、CD4、CD8、β-Catenin和E-Cadherin。全切片CD3?细胞密度通过Visiopharm/OracleBio图像分析流程测定（n=2466），TMA上T细胞通过QuPath定量。多重免疫荧光（mIF）采用CD3、CD8、FOXP3、CD68、αSMA和Pan-cytokeratin（PanCK）抗体组合，通过层次聚类（Ward法）后k均值聚类识别免疫细胞密度分组。DNA测序采用Agilent SureSelect CancerPlus panel进行突变分析。批量RNAseq采用TempO-Seq?技术。单细胞空间转录组学采用CosMx SMI 6000-plex平台对7例腺瘤TMA核心进行分析。统计方法包括Kaplan-Meier分析、log-rank检验、多变量二元逻辑回归、卡方检验和Mann-Whitney检验。
**研究结果**
**指数腺瘤中CD3?细胞密度与息肉切除术后监测期间异时性息肉或CRC相关**
对2466例指数腺瘤FFPE全切片进行组织分割和CD3?细胞检测后，计算腺瘤上皮和固有层中CD3?细胞密度。两个 compartment 中CD3?细胞密度呈强且显著正相关（rs=0.728，p<0.001），腺瘤上皮中位CD3?密度（121/mm2，IQR 75-186）低于固有层（2171/mm2，IQR 1554-2948）。CD3?密度二分类后，腺瘤上皮低密度组（≤85/mm2，n=765）和高密度组（>85/mm2，n=1701），固有层低密度组（≤1830/mm2，n=893）和高密度组（>1830/mm2，n=1573）。腺瘤上皮和固有层CD3?密度均与腺瘤大小（均p<0.001）和部位（均p<0.001）相关，仅固有层CD3?密度与组织学亚型相关。与低CD3?密度组相比，高CD3?密度腺瘤上皮组（p=0.004）和固有层组（p<0.001）在监测期间发现异时性息肉或CRC的患者显著更多。多变量分析中，校正性别、年龄、病变部位、大小、异型增生、组织学亚型和总息肉数后，CD3?密度仍与未来息肉或CRC风险独立相关：腺瘤上皮（OR 1.21，95% CI 1.01-1.45，p=0.042）和固有层（OR 1.44，95% CI 1.20-1.72，p<0.001）。
**腺瘤TMA中T细胞密度重现全切片发现**
为确认TMA提供可靠的免疫细胞评估平台，研究人员重复了CD3? IHC，可比染色支持TMA用于免疫分析的 validity（rs=0.477，p<0.001）。CD3?阳性细胞计数二分类后，腺瘤上皮（p=0.0018）和固有层（p=0.011）高CD3?密度与异时性病变检测时间缩短相关。TMA切片行CD4?和CD8? IHC，腺瘤上皮（p=0.005）和固有层（p<0.001）高CD4?密度与异时性病变检测时间缩短相关，而CD8?腺瘤上皮（p=0.078）和固有层（p=0.2）密度无显著关联。在进一步亚队列（n=102）中，配对指数和异时性腺瘤按解剖部位和异型增生分级匹配，固有层CD3?密度在指数和异时性腺瘤之间呈正相关（Spearman's rho=0.303，p=0.002）。
**腺瘤TMA中mIF识别的免疫细胞密度聚类揭示与未来息肉或CRC可能性相关的表型**
采用6-plex mIF panel在腺瘤TMA（n=331）中识别上皮和固有层中的适应性和固有免疫群体。基于固有层中CD3?、CD8?、FOXP3?、αSMA?和CD68?细胞密度的层次聚类后k均值聚类产生3组。Cluster 1具有高T细胞（CD3?、CD3?CD8?和CD3?FOXP3?）密度伴低CD68?和低αSMA?密度的混合表型（"适应性"浸润）。Cluster 2具有低T细胞密度、低CD68?和低αSMA?密度，呈全局免疫排斥表型（"免疫冷"）。Cluster 3显示高T细胞、高CD68?和高αSMA?密度（"混合"浸润）。聚类与年龄、性别、病变组织学、大小、部位、异型增生、阿司匹林或他汀处方、吸烟或BMI等既定风险因素无显著关联，但息肉组织学与免疫聚类显著相关（p=0.044）。随访期间发现异时性息肉或CRC的患者比例在各聚类间显著不同（Cluster 1：22%，Cluster 2：41%，Cluster 3：36%，p=0.032），时间事件分析亦如此（p=0.040），其中"适应性"Cluster 1风险最低，"免疫冷"Cluster 2风险最高。
**突变特征和批量转录组数据验证mIF腺瘤免疫聚类**
Agilent Cancer Plus panel突变数据显示Cluster 1与Cluster 2之间前12位突变基因频率无显著差异。然而，Cluster 1与Cluster 3之间HLA-A（27% vs 37%，padj<0.05）和KRAS（32% vs 47%，padj<0.05）至少一个突变样本比例存在显著差异，符合更免疫抑制或排斥的环境。IHC显示Cluster 2核β-catenin染色强度（中位H-score=131）显著高于Cluster 1（中位H-score=117）或Cluster 3（中位H-score=103）（p=0.006），膜E-cadherin H-score在聚类间无显著差异（p=0.507）。批量全人类转录组通过TempO-Seq检测显示，与Cluster 1相比，Cluster 2中免疫球蛋白相关基因（IGHG1、IGLC2、IGLV3.25）相对过表达，免疫-肿瘤相互作用及CRC和胃癌预后不良相关基因（POU2AF1和DERL3）上调。Cluster 3与Cluster 1相比亦显示免疫球蛋白基因（IGKV3.7、IGHV2.70D、IGHV1.69.2）过表达。MCPcounter估计组织浸润免疫和基质细胞群体相对丰度：T细胞基因表达特征在Cluster 1中显著高于Cluster 2或3（p<0.001），但CD8或细胞毒性T细胞基因特征评分无显著差异。成纤维细胞基因特征评分在Cluster 2中显著高于Cluster 1或Cluster 3（p<0.001）。
**空间分辨单细胞基因表达特征验证mIF腺瘤免疫聚类并揭示基于巨噬细胞表型和T细胞相互作用的适应性免疫排斥**
7例腺瘤TMA样本（Cluster 1 n=4，Cluster 2 n=1，Cluster 3 n=2）接受CosMx SMI 6000-plex单细胞空间转录组学评估。单细胞基因表达UMAP显示与mIF定义的三个免疫细胞密度组相关聚类。基因表达基于细胞分型后，上皮和免疫细胞类型密度在三组间显示变异。Cluster 1具有最大比例T细胞和B细胞（分别为6%和11%），而Cluster 2患者最低（1.4%和0.9%），但T细胞亚型相对比例在各聚类间相似。巨噬细胞和单核细胞总体比例相似，但最近邻分析提示Cluster 1和Cluster 3之间T细胞与巨噬细胞共定位存在差异。Cluster 1在半径0.02-0.03处显示适度正峰，随后主要为负值，表明CD68?巨噬细胞与CD8? T细胞之间以空间分离为主。相反，Cluster 3中CD68?巨噬细胞与CD8? T细胞之间存在显著的短程空间关联，在r=0.1处有强正聚类信号峰。CD8? T细胞在Cluster 1和Cluster 3之间差异基因表达很少，但Cluster 3中CD4? T细胞过表达抗原呈递和MHC II活性相关基因（HLA-DPB1、HLA-DRA、CD74）。两个聚类中CD68?巨噬细胞均过表达与免疫抑制或促肿瘤微环境相关的基因。
**讨论与结论**
本研究报道在2642例大型肠道筛查队列中，腺瘤内免疫浸润与6年监测期间异时性息肉和结直肠癌的发生相关。最初看似反直觉的发现——高CD3? T细胞密度与更高异时性病变风险相关——引导研究人员从mIF数据推导出新型腺瘤免疫聚类，提示三种表型：1）高T细胞密度、低巨噬细胞密度伴最低风险；2）免疫排斥伴最高风险；3）高T细胞、巨噬细胞和αSMA密度的中间风险组。这些分组与任何先前描述的患者、暴露或腺瘤内在风险因素无显著关联，但与未来风险相关。单细胞空间分辨基因表达分析进一步揭示固有层内巨噬细胞通常表达与免疫抑制和促肿瘤微环境相关的基因。然而，这些CD68?巨噬细胞与T细胞在腺瘤固有层内的距离在Cluster 1（空间分离）和Cluster 3（共定位程度更高）患者腺瘤之间存在差异。这表明腺瘤内固有-适应性免疫相互作用可能不仅与病变进展相关，还与切除后未来病变风险相关。传统腺瘤被认为起源于Wnt驱动的经典干细胞扩增，以LGR5表达为特征，位于隐窝基底，由包括APC、KRAS和SMAD4在内的基因突变序列引起，随后p53突变导致以染色体不稳定为特征的癌症。然而，该过程尚未完全理解，病变进展依赖于其他因素，包括局部免疫反应。腺瘤内免疫排斥表型的存在已被描述为癌前病变向侵袭性疾病进展的关键。本研究中，IHC检测的腺瘤上皮核β-catenin蛋白染色强度与免疫浸润之间存在关联，最高β-catenin H-score见于免疫排斥高风险组。此外，近期一项大型混合组织学结肠息肉队列研究显示，具有更晚期特征（包括绒毛状形态）的传统腺瘤上皮CD8? T细胞密度低于晚期特征较少者。尽管个体病变进展和异时性病变风险是不同的临床结局，但它们可能通过共同基本过程（如有效免疫编辑失败）相联系。结肠镜息肉切除术切除的腺瘤不再对患者构成直接风险，但可能存在更广泛的功能性免疫场改变或失调效应。本研究中一小部分患者指数和异时性病变CD3? T细胞密度存在适度关系。若考虑使用免疫特异性靶点进行预防，则需在结肠镜检查时的同步腺瘤以及背景看似正常的结肠黏膜中发现此类失调证据。免疫失调可能是原发事件，也可能由患者暴露组、微生物组或潜在多基因风险驱动。理解支撑这些及未来腺瘤和癌症风险的免疫联系可能是提供有效风险分层和结直肠癌预防的关键。本研究存在若干局限性：排除锯齿状病变因其远不如传统腺瘤常见且其BRAF、RAS和CpG岛甲基化驱动的生物学产生与传统腺瘤非常不同的免疫浸润；研究为回顾性，尽管纳入暴露数据和相关临床病理风险变量，但不能从免疫浸润观察与异时性病变结局之间得出因果关系；所有患者来自单一卫生委员会，需要外部验证；尽管NHS GGC是英国最大的此类委员会，大多数患者为白人，因此发现可能不适用于其他国家和种族群体；FFPE腺瘤全切片和TMA切片中测量的CD3? T细胞密度虽相关，但连续切片可能引入测量误差；mIF使用相比单重IHC可能引入进一步测量误差；CosMx分析样本量小，无法在单细胞空间转录组数据方面对最佳（Cluster 1）和最差（Cluster 2）临床结局组进行有用比较；mIF、RNAseq和空间转录组技术的使用目前在临床环境中不可行，但生成简化的IHC或H&E-based免疫浸润表型分类器的潜力可能允许在既定肠道筛查和监测方案中进行此类评估。总之，本研究证明腺瘤内免疫架构与异时性息肉或结直肠癌风险相关。这些发现突出免疫环境作为结直肠监测的潜在生物标志物和癌前干预靶点。随着对精准筛查、监测风险分层和癌前干预领域免疫反应调控兴趣的增加，理解这些机制对于将发现转化为临床实践至关重要。
