温度敏感突变体flo11-2揭示水稻垩白受开花顺序的影响强于碳水化合物供应

《Field Crops Research》：The temperature-sensitive mutant flo11-2 reveals that rice grain chalkiness is more strongly influenced by flowering order than by carbohydrate supply.

　　

背景与目的：水稻（Oryza sativa L.）籽粒垩白在高温（HT）和/或低太阳辐射条件下是严重问题。同一稻穗内不同籽粒的垩白程度存在差异，但稻穗内垩白的时空格局及其形成变异的潜在机制仍不清楚。方法：本研究利用温度敏感突变体flo11–2与野生型品种，在三年内通过四种短日照处理与三个氮素水平，阐明稻穗内垩白比率与籽粒面积的分布；并施加为期两天的高温处理，以考察灌浆期垩白易感性的时空变化。结果与结论：籽粒面积（可作为每个小穗可用碳水化合物的可能指标）在每条一次枝梗（PB）的上部与中部位置较大，且与PB在稻穗中的位置无关。相比之下，垩白比率的分布与籽粒面积分布明显不同，在覆盖较宽灌浆期范围的短日照处理下，其由顶部PB的上部籽粒向底部PB的下部籽粒逐渐变化。历时三年的氮肥处理进一步表明，上部粒位（G1）的籽粒面积显著大于下部粒位（G7），而上部枝梗位（B1）的垩白比率显著高于下部枝梗位（B10）。由于籽粒对高温的敏感性不同，花后13–14天（DAF）高于花后21–22天，垩白比率的分布可能受该敏感期与高温重合方式的影响。意义：水稻籽粒垩白受开花顺序的影响强于碳水化合物供应，本研究通过使用温度敏感突变体flo11–2首次证明了这一点。

研究背景方面，水稻是全球半数人口的主食，其产量与品质日益受到气候变化导致的气温升高威胁。灌浆期高温会增加未成熟白粒即垩白粒的发生，垩白粒外观品质差，降低碾磨品质、食味品质与市场价值，并造成显著产量损失。在籽粒内部，扫描电镜分析显示垩白胚乳由排列疏松的淀粉粒与蛋白体填充，淀粉粒呈球形并含多个空气间隙，引起光反射而呈垩白外观；高温改变水稻颖果组成，尤其是淀粉与贮藏蛋白，灌浆期高温下籽粒直链淀粉含量降低，蛋白贮藏液泡膨大而蛋白积累相对较少。在小穗之间，已有研究显示劣势小穗垩白粒比率更高、粒重更低，提示两类小穗间淀粉积累竞争可能参与垩白形成；早开花小穗因库容效率较高预期可产生高品质籽粒；人为降低稻穗下部一次枝梗光照会降低粒重并提高垩白粒比例；白腹垩白与花后20–30天（DAF）遮光导致的同化物供应不足相关；也有研究表明低垩白品种从稻穗顶部到中部籽粒面积的下降幅度更大，提示灌浆缓慢（即低碳水化合物胁迫）可缓解垩白；还有研究报道在开花后8–18天高温胁迫下，一次枝梗上顶部小穗（优势粒）垩白程度低于第二位小穗（劣势粒）。因此，许多既往研究强调碳水化合物供应与籽粒垩白相关，并认为小穗间碳水化合物可利用性可能不同。然而，有研究显示每个小穗可用碳水化合物（ACPS）未必与垩白相关，稻穗内垩白粒的空间分布仍不完全清楚，需要进一步细致研究。高温对籽粒垩白的影响取决于其发生时间、持续时间与强度；灌浆期被划分为淀粉积累阶段（6–20 DAF）与籽粒成熟阶段（21–30 DAF）；有研究证明淀粉积累早期（5–10 DAF）与晚期（15–20 DAF）高温分别产生乳白粒与白背、基白和白腹粒；0–15 DAF日均温高于25–27 ℃增加垩白粒发生，0–20 DAF高于27–28 ℃增加白背与基白粒发生率，18–28 DAF高温也增加垩白粒百分比；有研究显示自3和26 DAF开始的三天高温处理均显著增加基白与白背垩白粒百分比。尽管已有大量田间与人工生长箱研究，垩白粒发生的最关键发育阶段仍未解决。从生理养分角度，施氮可减少垩白粒发生；适度施氮促进灌浆并改善劣势粒与优势粒的品质（即粒长与粒宽），从而降低籽粒垩白；氮肥通过降低颗粒结合型淀粉合成酶I（GBSSI）的直链淀粉合成活性、增加支链淀粉与某些氨基酸合成来平衡蛋白与淀粉组成，可能有助于改善品质；有研究证明高温下13-kD醇溶蛋白随GBSSI表达降低而减少，而施氮通过增加主要积累谷蛋白的蛋白体II填充高温胁迫造成的细胞质空间；尽管许多研究记录了施氮与灌浆特性的关系，但氮处理的位置特异性效应仍不清楚。近期，有研究从碳离子辐照“日本晴”株系中分离出条件性垩白粒突变体flo11–2，该突变体在淀粉体定位的70 kDa热激蛋白2（cpHSP70–2）保守区携带单氨基酸替换，导致其ATP酶活性降低23%；在低温（日均温24 ℃）下flo11–2籽粒外观与野生型相似呈半透明，但在高温（日均温28 ℃）下垩白显著高于野生型，提示cpHSP70–2缺陷降低了淀粉体定位酶（如淀粉合成酶）的转运，使淀粉体在高温下无法满足淀粉合成需求；据研究人员所知，尚无其他机制明确解析的温度敏感垩白粒突变体报道；值得注意的是，cpHSP70–2的作用似乎独立于淀粉与糖代谢，而后者会直接影响籽粒垩白；利用flo11–2对高温的高敏感性，有研究证明高温下稻穗内垩白比率存在显著变异，但其机制仍未知。本研究通过分离稻穗内PB及其上籽粒来分析垩白比率变异，首先利用短日照处理在较宽灌浆期范围内同步籽粒发育，随后在三年内以三个氮素水平完成试验，所用材料为温度敏感突变体flo11–2；本研究首次详细报道稻穗内垩白粒与籽粒大小（作为ACPS的替代指标）的分布，从而为水稻籽粒垩白潜在机制提供新见解。

研究人员开展的研究：研究在日本京都大学实验农场以田间试验或盆栽试验进行，盆栽采用1/5000-a Wagner盆（深19.5 cm、直径16 cm、土壤表面积200 cm²）；材料包括温度敏感突变体flo11–2及野生型品种日本晴（Nipponbare）与金南风（Kinmaze）；flo11–2分离自离子束辐照的日本晴，在质体定位70 kDa热激蛋白2（cpHSP70–2）保守ATP酶结构域携带氨基酸替换，ATP酶与分子伴侣活性低于野生型；Kinmaze传统用于日本清酒酿造；2018、2020、2021、2022年分别于4月23、21、27、25日播种，5月18、15、20、19日移栽。短日照处理于2018年进行，田间小区（5 m×10 m）分为SD1、SD2、SD3、SD4四部分，各1.25 m×10 m（12.5 m²），三基因型均匀种植；SD1、SD2、SD3依次用黑色乙烯基膜覆盖（覆盖两侧与顶部，17:00–07:00保持黑暗）一周以加速抽穗并使稻穗在灌浆期经历不同温度模式；短日照处理分别于6月14日（SD1）、6月21日（SD2）、6月28日（SD3）开始，SD4为自然日长对照；氮肥以6 g N m^?2基施（包膜尿素LP-100，JCAM AGRI Co. Ltd.，东京，日本），并配施P₂O₅（6 g m^?2）与K₂O（10 g m^?2）。氮处理于2020、2021、2022年使用突变体flo11–2，田间小区（5 m×10 m）用塑料板分为三部分，各1.65 m×10 m（16.5 m²）；2020与2021年施氮量设0、6、20 g N m^?2（0 N、6 N、20 N），6 N仅基施，20 N为基施（10 g N m^?2）＋分蘖盛期（6 g N m^?2）＋抽穗期（4 g N m^?2）分次施用；基施氮肥（包膜尿素LP-100，JCAM AGRI，东京，日本）配施P₂O₅（6 g m^?2）与K₂O（10 g m^?2），分次追肥使用硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]；2022年施氮量为6、12、18 g N m^?2（6 N、12 N、18 N），6 N基施，12 N为基施（6 g N m^?2）＋分蘖盛期（6 g N m^?2），18 N为基施（6 g N m^?2）＋分蘖盛期（6 g N m^?2）＋抽穗期（6 g N m^?2），其他施肥条件同2020与2021年。所有田间试验记录各品种与突变体抽穗期以估算灌浆期；成熟期每小区每品种与突变体收获10穴风干，随机取4–8个稻穗（每穴一穗）作为重复用于后续分析；气温用传感器与数据记录仪（Wireless Thermo Recorder RTR-53A，T&D，松本，日本）每10分钟测定。2022年对突变体flo11–2进行两天高温处理，每盆移栽20株（1/5000-a Wagner盆，共3盆），盆内为混施NPK（8:8:8）复合肥的水稻土，按循环密植法栽培；肥料以4.5 g pot^?1（0.36:0.36:0.36）基施；每株仅保留主茎至成熟，及时去除分蘖；孕穗期移至人工气候室，气温维持25 ℃/25 ℃（昼/夜），光强不人工控制而依赖自然光；两天高温处理时，两盆分别在特定灌浆阶段（8月28–29日与9月5–6日）暂时移至生长箱（NK System LH-241SP，Nihon Ika Kikai，大阪，日本），模拟2018年8月3日京都日均气温28.7 ℃的炎热夏季温度模式，温度 regime 通过将最低温提高2.3 ℃、最高温降低2.7 ℃调整，同时保持相同日均温（28.7 ℃）；两天高温处理后盆返回人工气候室至成熟；一盆全程留在人工气候室作为对照；生长箱光强由0 μmol m^?2 s^?1（夜间）阶梯式增至最大460 μmol m^?2 s^?1（白天）；记录每穗开花日期以确定两天高温处理开始时的DAF；成熟期收获所有稻穗并按处理开始时DAF分组；对在不同成熟阶段（13–14与21–22 DAF，各n=6）暴露于两天高温或未暴露（对照，n=11）的稻穗进行详细分析。所有试验中稻穗成熟期收获并风干两周；用自制工具（两个不锈钢盘）从每穗手工脱取完整稻粒，盘口相对合拢；未脱壳籽粒用试验碾米机（Fujiwara Scientific Co., Ltd.，东京，日本）手工脱壳获得糙米；每穗全部糙米籽粒的侧面图像用籽粒扫描仪（RSQI10A，Satake Inc.，广岛，日本）集中扫描；用籽粒扫描仪记录每粒的垩白比率（垩白面积占总籽粒面积的比例）与籽粒面积；两天高温处理中计算每穗平均垩白比率；位置特异性分析时，用96孔培养皿按PB位置及每PB内粒位对稻穗内籽粒排序；若存在二次枝梗上的籽粒，则按相应PB籽粒处理并保持其相对位置顺序；用籽粒扫描仪单独测定垩白比率与籽粒面积；用Sartorius C5称量单元（Micro Balance M，Sartorius，德国）记录每粒粒重以确认籽粒面积与粒重的关系；用体视显微镜（SZX7，Olympus，东京，日本）与扫描电镜（Miniscope TM3000，Hitachi，东京，日本）观察横切面。统计分析使用Bell Curve for Excel（ver. 3.21，Social Survey Research Information，东京，日本）。

研究结果：3.1 田间与盆栽试验的气温。2018年短日照处理中，SD1、SD2、SD3较SD4分别提前抽穗25、18、14天；Tmax、Tmean、Tmin在8月中旬前保持较高且相对稳定，届时SD3已过20 DAH；气温在8月16–20日暂时显著下降，此时SD4处于6–10 DAH；此后气温回升再逐渐下降；因此20 DAH平均Tmax、Tmean、Tmin*在SD1较SD4分别高1.0、2.0、1.4 ℃，SD2分别高0.4、1.0、0.9 ℃，SD3分别高0.0、0.6、0.9 ℃；8月中旬的暂时降温在SD1、SD2、SD3发生于籽粒成熟阶段，而在SD4发生于灌浆早期。2022年两天高温处理中，生长箱Tmax、Tmean、Tmin分别为34.2、28.7、24.7 ℃，与2018年8月3日稻田（36.9、28.7、22.4 ℃）相当，而与2022年8月20日人工气候室（28.1、25.1、22.3 ℃）不同。氮处理中，2020年气温较高、2021年较低、2022年中等，前10 DAH平均Tmean分别为31.0、24.1、27.0 ℃，前20 DAH分别为30.3、25.5、26.6 ℃；相应平均Tmin前10 DAH分别为23.8、21.7、23.7 ℃，前20 DAH分别为23.9、22.1、23.0 ℃；2022年14–15 DAH Tmin暂时降至17–18 ℃，而2021年17 DAH后Tmin降至21 ℃或以下。3.2 高温下稻穗内垩白比率与籽粒面积的分布。短日照处理下突变体flo11–2稻穗内，70个粒位平均垩白比率在SD1、SD2、SD3分别较SD4高2.1、2.3、2.4倍；SD1中垩白比率在顶部PB下部籽粒与底部PB上部籽粒较高，SD2与SD3中多数顶部PB籽粒及多数PB上部籽粒普遍较高；SD4中垩白比率也倾向于由顶部PB上部籽粒向底部PB下部籽粒逐渐变化；70个粒位平均籽粒面积在SD1、SD2、SD3较SD4略高（1.1倍）；所有PB上籽粒面积以中部籽粒最高，其次上部籽粒，再次下部籽粒，表明flo11–2稻穗内籽粒面积空间分布与垩白比率不同；比较B1与B10、G1与G7，籽粒面积在G1显著高于G7，而垩白比率无显著差异；B1与B10间垩白比率与籽粒面积均无显著差异。野生型（日本晴与金南风）短日照处理下，70个粒位平均垩白比率在SD1较SD4分别高4.7与4.8倍，但两品种平均垩白比率远低于突变体flo11–2，SD1中低2.5–3.4倍，SD4中低5.8–7.7倍；SD1与SD4垩白比率差值对flo11–2、日本晴、金南风分别为0.25、0.11、0.15点；稻穗内垩白比率空间分布格局不清晰，可能因两品种对高温敏感性低；70个粒位平均籽粒面积在日本晴SD1与SD4几乎相同，在金南风SD1低于SD4，其原因本研究未确定；所有PB上籽粒面积以中部最高、其次上部、再次下部，表明野生型与flo11–2稻穗内籽粒面积空间分布相似。3.3 氮肥对垩白比率与籽粒面积分布的影响。2020年高温年份，70个粒位平均垩白比率在6 N与20 N较0 N分别低4%与29%；稻穗内垩白比率分布格局不甚明显，部分因重复数少（n=4），但似与短日照处理所见相似；70个粒位平均籽粒面积在6 N与20 N较0 N分别低1%与5%；稻穗内籽粒面积分布基本与短日照处理相同，但0 N下籽粒面积倾向于顶部PB高于中部与底部PB。2021年低温年份重复相同氮处理，70个粒位平均垩白比率在6 N与20 N较0 N分别低30%与55%；稻穗内垩白比率分布与短日照处理相似；70个粒位平均籽粒面积处理间无差异；稻穗内籽粒面积分布基本与短日照处理相同；0 N下籽粒面积倾向于顶部PB高于中部与底部PB。2022年中等温度年份施用略有不同的氮处理（6 N、12 N、18 N），70个粒位平均垩白比率在12 N与18 N较6 N分别低11%与19%；稻穗内垩白比率分布格局不甚明显，但似与短日照处理相似；70个粒位平均籽粒面积处理间无差异；稻穗内籽粒面积分布与短日照处理相同。因此，三年试验中高氮施肥似乎在整个稻穗上均匀降低垩白比率而非位置特异性，且对籽粒面积分布影响很小；与短日照处理所见一致，籽粒面积在G1显著高于G7而垩白比率无显著差异；与B10相比，B1垩白比率显著更高（p<0.05）并倾向于籽粒面积更大。3.4 两天高温处理对籽粒垩白的影响。2022年稻穗较短，仅分析G1–G7与B1–B8小穗；对照（Cont）处理垩白比率低且无明显分布偏倚；13–14 DAF处理在上部枝梗位的上部籽粒观察到较高垩白比率，21–22 DAF处理在下部枝梗位的下部籽粒观察到相对较高垩白比率；此外，对高温的敏感性13–14 DAF似乎高于21–22 DAF，因为G1–G7与B1–B8小穗平均垩白比率在13–14 DAF与21–22 DAF处理分别较Cont高100%与20%；结果表明随着高温处理时间改变，垩白热点沿开花顺序梯度逐渐位移。

讨论部分总结：4.1 垩白粒的空间分布及其与籽粒面积的关系。稻穗内垩白粒分布似由顶部PB上部籽粒向底部PB下部籽粒逐渐变化，该格局不同于籽粒面积分布（后者无论PB位置如何均以中部或最上部籽粒大于下部籽粒）；垩白与籽粒面积空间分布的差异提示水稻籽粒垩白很少受ACPS影响，这与既往报道一致；有研究者将垩白粒分为白背、基白、乳白、心白与白腹等类型，有研究报道高温下白背与基白粒增加，有研究指出乳白粒在劣势小穗中增加，而另有研究与研究提示低太阳辐射下心白粒增加；本研究因技术限制未对垩白粒分类，但flo11–2与野生型中观察到的垩白比率与籽粒面积分布差异表明乳白与心白粒并非主要类型，垩白的主要原因不是碳水化合物供应受限。同时，稻穗内开花由顶部PB向底部PB推进，在一次（及二次）枝梗内先由最上部小穗开始，随后最下部小穗，再向上推进至顶部第二小穗；为可视化稻穗内整体开花顺序分布，研究人员按本研究程序重新整理前人报道的数据，表明开花由顶部PB上部小穗向底部PB下部小穗推进（如对角线方向）；该分布趋势也在B1–B10枝梗内G1–G7小穗间观察到，与垩白粒分布类似；由于垩白对高温的敏感性在灌浆期变化，水稻籽粒垩白可在很大程度上受开花顺序及高温发生时小穗发育阶段影响。4.2 前20 DAF平均温度与氮肥。有研究基于田间、人工气候室与部分空调温室等多种环境数据报道Tmax是影响水稻籽粒垩白最重要的环境因子；同时，本研究中短日照处理SD3较SD4垩白比率更高可能由Tmin差异引起，因为两处理前20 DAF平均Tmax相同；前20 DAF平均温度（Tmean、Tmax、Tmin）由SD1至SD3下降，而flo11–2突变体B1–B10枝梗G1–G7籽粒平均垩白比率却增加；氮处理中垩白比率2020年最高、2022年次之、2021年最低，与对应前20 DAF Tmean降低顺序一致；尽管2022年16 DAF前Tmin暂时显著下降，类似2018年SD4处理，2021年垩白比率仍低于2022年；这些结果提示除前20 DAF平均温度外，环境因子的特定敏感期可能是籽粒垩白的关键决定因素。氮肥处理中B1枝梗垩白比率显著高于B10枝梗；短日照处理间温度变化大，导致B1与B10枝梗垩白比率无显著差异；相比之下，三年氮处理中B1与B10枝梗间开花期相对温度变化可能一致，这可能解释B1与B10枝梗间垩白比率显著差异。4.3 改善籽粒垩白的展望。根据开花顺序报道，开花有两个高峰：一个主要为PB上小穗，另一个主要为二次枝梗上小穗，两峰相隔约两天，这种分离特性可能有助于风险分散；同时，有研究报道优势小穗（主要为PB上籽粒）最大小穗生长速率更高、生长持续时间更短，劣势小穗（主要为二次枝梗上籽粒）则相反；因此，若能通过育种或栽培技术避开对高温最敏感的发育阶段，通过缩短开花期降低二次枝梗小穗相对PB小穗的比例，可能通过缩短高风险期有效降低稻穗内垩白粒平均发生率。施氮是减少垩白的可行技术，但可能提高籽粒蛋白浓度，这在包括日本在内的一些国家不受欢迎，因为会降低食味品质；若阐明施氮降低垩白的分子机制，可利用施氮的下游因子在不额外施氮的情况下减少垩白；flo11–2突变体因其对高温的高敏感性将成为此类研究的有用材料。结论翻译：稻穗内垩白比率由顶部PB上部籽粒向底部PB下部籽粒逐渐变化，与开花顺序分布一致；同时，代表ACPS的籽粒面积在各PB内上部或中部位置较大，与垩白比率分布格局不同；成熟籽粒对高温的垩白易感性在灌浆期变化；施氮在所有温度条件下均降低垩白，其效应在稻穗内似乎无位置特异性；flo11–2突变体可作为水稻籽粒垩白研究的有用材料。