《Food Chemistry: X》：Formation and contribution of flavor precursors in beef tallow/palm oil blend: Synergistic effects of enzymatic hydrolysis, mild thermal oxidation, and controlled Maillard reaction
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本研究旨在探究酶解-温和热氧化处理对牛油/棕榈油复配体系在脂质-美拉德反应体系中理化性质及挥发性化合物形成的影响。首先测定五种美拉德反应产物（MRPs）的pH、褐变强度及色泽，采用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）分析不同MRPs中关键功能基团类别的变化，通过
本研究旨在探究酶解-温和热氧化处理对牛油/棕榈油复配体系在脂质-美拉德反应体系中理化性质及挥发性化合物形成的影响。首先测定五种美拉德反应产物（MRPs）的pH、褐变强度及色泽，采用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）分析不同MRPs中关键功能基团类别的变化，通过固相微萃取/气相色谱-质谱联用（SPME/GC–MS）对MRPs中的关键挥发性化合物进行鉴定与定量，并采用电子鼻（E-nose）与顶空气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）评价火锅油的整体香气特征，结合主成分分析（PCA）阐明样品间的气味差异。结果表明，酶解-温和热氧化-美拉德序贯处理增强了香气复杂性；酶解牛油/棕榈油复配美拉德反应产物（ECT/EOCT-MRPs）中的低pH通过调控反应路径塑造了挥发性轮廓；脂质-美拉德相互作用促进了关键风味活性化合物的生成；由EOCT-MRPs制备的火锅油中挥发性物质显著富集。
研究背景：牛油因其良好的流动性和延展性被广泛用于起酥油、人造奶油等食品加工原料，其独特的脂香和醇厚牛肉风味也使其成为重庆火锅的重要组分。在火锅体系中，牛油因高熔点和脂肪晶体网络可在常温下提供固体稠度，加热时逐渐融化形成丰富口感；煮沸时可形成水包油乳液，其稳定性决定汤汁质构，失稳则导致不良的"浑汤"现象；此外牛油的亲脂性使其能够承载香料中的脂溶性风味化合物，在口腔温度下固化形成薄膜从而增强风味保留。然而牛油含约50%饱和脂肪酸和50–300 mg/100 g脂肪的胆固醇，被视为心血管疾病和冠心病的主要诱因。随着健康饮食需求增长，寻找可行的动物脂肪替代物日益迫切。目前牛油替代研究主要集中于棕榈油、大豆油和菜籽油等植物油脂，采用直接替代或改性策略。多数商业植物基火锅底料使用菜籽油或大豆油，但其高不饱和脂肪酸含量导致形状不规则和半固体质地，在储运方面存在挑战。棕榈油因其适用性优越而成为更合适的替代品，具有成本效益、较高的维生素A/E含量和氧化稳定性等优势，这对高温食品加工应用至关重要。由于天然半固体稠度和脂肪酸组成，棕榈油表现出与牛油相当的质构特性和结构稳定性，有助于获得理想的口感和融化行为。此外，与牛油相比棕榈油饱和脂肪酸和胆固醇含量更低，且仅有有限科学证据表明棕榈油是心血管疾病的危险因素。因此棕榈油可作为火锅底料配方中牛油的理想替代品。在加工食品体系中，两个关键反应显著影响风味形成：美拉德反应和脂质降解。美拉德反应在食品加工中尤为关键，可产生丰富的风味化合物和类黑精，不仅提供诱人色泽还带来特殊风味，是制备天然风味增强剂的关键途径。为优化风味形成，可将蛋白酶水解产生的短链肽和游离氨基酸作为风味前体添加，其在热加工过程中与还原糖反应生成吡嗪和呋喃等挥发性风味化合物。Eric等（2013）报道，由木糖、半胱氨酸和向日葵蛋白水解物制备的MRPs具有强烈的肉味和抗氧化活性，表明该反应在食品设计中具有双重功能益处。脂质降解包括氧化和酶解途径，在风味发展中起重要作用。脂质氧化和降解产生的脂肪族醛类及相关化合物是特征肉风味的直接来源。此外，脂质降解产生的羰基化合物可作为美拉德反应的前体，通过与氨基化合物的相互作用促进风味复杂性。虽然适度脂质氧化对形成理想香气至关重要，但过度氧化会产生不良气味和风味。Song等（2014）证实酶解-温和热氧化牛油对牛肉特征风味的形成有积极贡献。类似地，Ye等（2022）报道了一种牛油酶解-热氧化方法，可显著富集植物基MRPs中含氧、含硫和含氮杂环挥发性化合物。本研究旨在探究酶解-温和热氧化处理对牛油/棕榈油复配体系在脂质-美拉德反应体系中理化性质及挥发性化合物形成的影响。
研究方法：研究人员将牛油（T）与棕榈油（P）按2:1（w/w）比例复配得CT，与磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.0）按3:5（w/v）混合，加入米曲霉脂肪酶（酶-底物比420 U/g）于57 °C搅拌7 h，95 °C水浴灭酶20 min；冷却后加入脂肪酶TYPE VII（1340 U/g）于45 °C搅拌5 h，灭酶后得酶解复配牛油（ECT）。将ECT（100 g）置于三颈圆底烧瓶，于90 °C油浴中搅拌（200 rpm）加热5 h，以80 L/h流速通入空气，反应完成后冰水浴快速冷却，于?20 °C储存，记为EOCT。将1.2 g L-半胱氨酸、4 g D-(+)-木糖和10%脂质（P、T、CT、ECT或EOCT）与40 mL牛骨酶解液混合，于110 °C油浴、pH 7.2条件下搅拌90 min，所得产物分别命名为P-MRPs、T-MRPs、CT-MRPs、ECT-MRPs和EOCT-MRPs，对照样品除不加脂质外其余步骤相同。采用数字pH计测定pH，紫外-可见分光光度计测定420 nm和294 nm处吸光度（样品稀释20倍）表征褐变强度，色差仪测定色泽。采用FT-IR记录不同MRPs的红外光谱（4000–400 cm?1，分辨率4 cm?1）。采用SPME/GC–MS鉴定与定量挥发性化合物，以1,2-二氯苯为内标进行半定量。采用电子鼻（6个传感器sn-1至sn-6）分析火锅油气味轮廓，采用HS-GC-IMS分析火锅油挥发性化合物。数据以均值±标准差表示，采用SPSS 27.0进行单因素方差分析（p < 0.05），TBtools构建热图，Origin 2018进行PCA分析。样本来源：牛油由重庆帅克食品有限公司提供，棕榈油和混合香料包购自当地超市。
研究结果：
3.1 MRPs在pH、褐变强度和色泽方面的差异：五种MRPs组的pH值均显著低于对照组（p < 0.05），其中ECT-MRPs和EOCT-MRPs的pH值最低，分别为4.81和4.52，这可能归因于美拉德反应过程中氨基的消耗、有机酸的形成以及还原糖分子在高温下反应活性的增强，此外牛油的酶处理可能促进游离脂肪酸的释放从而导致pH降低。ECT-MRPs和EOCT-MRPs中的低pH可能有利于某些反应路径（如通过1,2-烯醇化途径形成糠醛），同时可能抑制其他路径（如Strecker降解），从而塑造其特定的挥发性轮廓。ECT-MRPs和EOCT-MRPs在294 nm处的吸光度高于CT、T和P组，EOCT-MRPs在420 nm处吸光度最高，其次为ECT-MRPs（p < 0.05），表明EOCT比ECT更有效地促进美拉德反应中类黑精的形成。与对照相比，五种MRPs的L*值分别为35.79、33.72、35.57、30.96和38.71，ECT-MRPs的轻微降低可能归因于脂肪氧化和降解降低了体系亮度；a*值为3.18–5.08，b*值为5.58–6.70，五种MRPs的a*和b*均高于对照，其中EOCT-MRPs最高，其次为ECT-MRPs，T-MRPs和CT-MRPs值相近，与其油料成分组成相似有关。
3.2 FT-IR分析：约2999和2800 cm?1处吸收峰归因于饱和亚甲基（-CH?-）的CH伸缩振动，反映长链脂肪酸的存在；与P-MRPs、T-MRPs和EOCT-MRPs相比，CT-MRPs和ECT-MRPs在2825 cm?1处显示较低值。约1745–1706 cm?1吸收带归属为C=O伸缩振动，P-MRPs、T-MRPs和CT-MRPs的峰位于1743–1749 cm?1，主要归因于脂质的甘油三酯酯键，而ECT-MRPs和EOCT-MRPs的峰显著移至1706 cm?1，该带为共轭醛、酮或羧酸中C=O伸缩的特征，表明酶解-温和热氧化处理生成了大量新的非酯化羰基化合物，GC–MS分析证实ECT-MRPs和EOCT-MRPs含有较高水平的酸和醛。约1293–1163 cm?1的谱带对应C-O伸缩振动，P-MRPs、T-MRPs和CT-MRPs在约1162 cm?1处有峰，ECT-MRPs和EOCT-MRPs在该区域消失但在约1290 cm?1处出现新的强吸收峰，该带与美拉德反应形成的呋喃/吡喃杂环中不对称C-O-C伸缩有关，标志着更多含氧杂环化合物的形成。P-MRPs、T-MRPs和CT-MRPs的峰位于约966–957 cm?1，为反式双键特征区域，ECT-MRPs和EOCT-MRPs的峰显著移至约942和939 cm?1，在含半胱氨酸（硫源）和氨基酸/肽（氮源）的体系中，该位移可能指向含硫或含氮杂环风味前体，如某些噻吩（含硫）或吡咯（含氮），它们是肉味的关键贡献者。
3.3 MRPs中的挥发性化合物：通过SPME/GC–MS在五种MRPs中共鉴定出136种挥发性化合物，包括醇类（15）、醛类（18）、酮类（11）、酸类（14）、酚类和烃类（30）以及杂环化合物（45）。ECT-MRPs和EOCT-MRPs的挥发性化合物浓度和多样性高于其他组，且ECT-MRPs与EOCT-MRPs之间挥发性组成相似性更近，表明其形成过程中存在共享反应路径。呋喃是五种MRPs中最丰富的挥发性化合物，其次为酚类、烯烃、酸类、醛类、噻吩、噻唑和醇类。醇类主要来源于脂肪酸的氧化降解和Strecker反应，共鉴定出15种醇，包括1-己醇、1-庚醇、1-辛醇和1-辛烯-3-醇，其中1-辛烯-3-醇与牛肉甜味相关，归因于亚油酸氧化并贡献蘑菇样风味。醛类通过自由基链反应由脂质氧化产生，EOCT-MRPs中浓度最高（1325.18 ng/mL），其次为ECT-MRPs（1306.74 ng/mL），五种MRPs中常见的醛类包括辛醛、壬醛、癸醛、苯甲醛和2-庚烯醛，具有青香、芳香、油香和脂肪香气。ECT-MRPs和EOCT-MRPs中酮类的种类和含量显著高于其他三种MRPs，EOCT-MRPs酮类含量最高（457.69 ng/mL），T-MRPs最低（1.61 ng/mL），1-辛烯-3-酮贡献金属和蘑菇样风味。五种MRPs中存在的酸类包括乙酸、辛酸、戊酸、己酸、庚酸、丁酸和壬酸，己酸和壬酸为牛肉风味中的气味活性化合物，贡献甜味和牛脂样属性。醇、醛、酮、酸和酯类通常具有较高感官阈值，对感知感官特性的直接影响有限，但这些化合物可作为美拉德反应的关键中间体参与新风味化合物的形成，也可与其他挥发性化合物协同互补丰富整体风味复杂性。在各类MRPs中，含氧杂环（如呋喃）、含硫化合物（包括硫醇、噻吩和噻唑）以及含氮杂环（如吡嗪、吡啶等）在风味发展中起关键作用。P-MRPs中呋喃含量（6465.02 ng/mL）显著超过T-MRPs（2457.81 ng/mL）和CT-MRPs（4969.37 ng/mL），表明不饱和度增加可能促进呋喃形成；ECT-MRPs（8666.98 ng/mL）和EOCT-MRPs（18,710.62 ng/mL）中观察到更高呋喃浓度，表明酶解结合温和热氧化可有效促进呋喃化合物的生成。糠醛在所有MRP样品中浓度最高，贡献焦糖样风味，可与H?S反应形成2-糠硫醇；2-戊基呋喃在P-MRPs、CT-MRPs、ECT-MRPs和EOCT-MRPs中检测到，具有果香和草香。MRPs中的噻吩主要为7-甲基噻吩并[3,2-b]吡啶、4-甲基-5-噻唑乙醇和2-噻吩甲醛，其中2-噻吩甲醛被视为肉味相关风味体系的关键贡献者。此外，吡嗪类（如2,3-二乙基吡嗪）和其他含氮杂环存在于所有五种MRPs中，可能贡献烘烤和坚果风味。
3.4 MRPs中关键挥发性化合物的可能形成路径：脂质体系中关键挥发性化合物通常来源于脂质氧化降解、美拉德反应及其相互作用。棕榈油和牛油中油酸和亚油酸的热诱导氧化降解促进了脂质来源氧化产物和脂质-美拉德反应产物的形成。亚油酸在热处理下的氧化降解途径可生成氢过氧化物包括9-OOH和13-OOH，13-OOH可裂解形成1-辛烯-3-醇，进一步氧化为1-辛烯-3-酮，为肉味强贡献者；9-OOH降解导致不饱和醛的形成，如2-辛酮和(E,E)-2,4-癸二烯醛。此外，脂质来源的α,β-不饱和醛可与氨基酸反应形成2-烷基呋喃，进一步增强体系中的烘烤、甜香和植物香气。"还原糖-半胱氨酸"模型体系已被广泛认为是研究肉味挥发性化合物的经典反应体系，在该体系中木糖和半胱氨酸的Amadori重排生成3-脱氧戊糖酮，经环化和脱水产生糠醛，糠醛可进一步与H?S反应形成2-糠硫醇。作为含硫氨基酸，半胱氨酸可经Strecker降解产生H?S和NH?，随后参与美拉德反应生成各种肉味化合物。脂质氧化降解产生的小分子羰基化合物（如醛、酮和酸）不仅贡献香气轮廓，还作为美拉德反应的活性中间体。ECT和EOCT可能显著增强美拉德体系，醛类特别是不饱和醛（如2-癸烯醛和壬醛）易于与氨基酸和美拉德来源产物（H?S和NH?）反应，例如H?S与脱氧酮反应形成噻吩，而H?S/NH?与脂质来源醛/酮之间的协同相互作用通过加成、脱水和氧化反应生成噻唑和二氢噻唑，这些含硫杂环被认为是熟肉制品的特征香气成分。
3.5 火锅油的电子鼻分析：电子鼻系统配备六个专用传感器，分别靶向烷烃（sn-1）、醇类/醛类/短链烷烃（sn-2）、臭氧（sn-3）、硫化物（sn-4）、有机胺（sn-5）、有机气体/苯类/醛类/芳香化合物（sn-6）。F5整体风味轮廓响应更突出，尤其在sn-6和sn-1上响应强度更强（p < 0.05），表明F5中烷烃、芳香化合物和醛类浓度更高；F4显示与F5相似的风味轮廓但响应强度略低。PCA分析证实了这些差异，F5位于第一象限的独特空间位置，与其他组明显分离，F4位于第四象限，F1、F2和F3聚集在第二和第三象限，表明F5和F4形成具有类似挥发性组成的相关组，而F1、F2和F3聚集在一起具有相似风味特征。
3.6 火锅油的GC-IMS分析：通过保留指数、保留时间和漂移时间对火锅油中挥发性化合物进行定性分析，共鉴定出74种挥发性化合物，包括醇类（17）、醛类（16）、酯类（9）、酮类（7）、萜类（6）、醚类（5）、烃类（3）、吡嗪类（3）、呋喃类（3）、吡啶类（2）、酸类（2）和酚类（1）。由于浓度和理化性质不同，某些挥发性化合物（如己醇、2-糠醛和柠檬烯）以单体和二聚体形式被鉴定。画廊图显示样品间挥发性组成相当但浓度差异显著，F4和F5显示某些挥发性化合物的显著富集，特别是丁醛、5-甲基-2-呋喃甲醛（单体和二聚体）和二甲基二硫醚；F4中正辛醇、芳樟醇氧化物和(E)-2-辛烯醛浓度高于其他样品，而F5中2-甲基丁酸甲酯（单体和二聚体）、己酸甲酯（单体和二聚体）、二甲基三硫醚和2-戊基呋喃水平升高。2-戊基呋喃具有熟香、果香和焦糖气味，也被认为是脂质氧化的指标。PCA分析显示样品间除F2和F3外存在明显区分。
讨论与结论：本研究通过酶解-温和热氧化与美拉德反应联合改性牛油和棕榈油，表明脂质-美拉德相互作用显著促进了关键挥发性化合物的形成，包括呋喃、醛类、噻吩和噻唑，这些化合物被公认为肉味、烘烤和脂肪香气的积极贡献者。当改性油脂 incorporated 到火锅调料中时，火锅油的整体气味轮廓和挥发性多样性得到显著丰富，电子鼻响应增强和GC-IMS指纹图谱证实了这一点。这些发现表明，联合处理不仅改变了挥发性组成，而且将其转向基于已鉴定化合物已知感官属性预期感官上有利的轮廓。本研究可能为动物-植物脂质体系中的风味优化提供系统框架，对增强火锅调料和其他脂肪基食品的开发具有直接实际意义。
