《Food Structure》：Unravelling structural changes in pulse proteins during heat-induced gelation
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采用实时傅里叶变换红外（FT-IR）光谱和内源荧光光谱追踪了脉冲蛋白在热诱导凝胶化过程中的结构转变。蛋白质去折叠先于凝胶形成起始。变性先于分子内β-折叠向分子间β-折叠的转变。β-折叠的形成和荧光强度的增加表明网络的形成。尽管结构转变相似，最终凝胶强度存在差异
采用实时傅里叶变换红外（FT-IR）光谱和内源荧光光谱追踪了脉冲蛋白在热诱导凝胶化过程中的结构转变。蛋白质去折叠先于凝胶形成起始。变性先于分子内β-折叠向分子间β-折叠的转变。β-折叠的形成和荧光强度的增加表明网络的形成。尽管结构转变相似，最终凝胶强度存在差异。研究人员假设鹰嘴豆、蚕豆、扁豆、豌豆和大豆蛋白经历不同的温度依赖性转变，包括三级结构去折叠和二级结构重排，最终导致不同的凝胶化机制。因此，本研究旨在研究跨多个层级结构的温度依赖性结构转变并表征潜在的凝胶化机制。为此，采用原位FT-IR光谱通过特征酰胺I区（amide I）的温度诱导位移监测加热和冷却过程中二级结构的变化。采用原位内源荧光光谱通过测量色氨酸（tryptophan）残基的内源荧光追踪去折叠和聚集过程中三级结构的变化。通过原位光谱监测的二级和三级结构中的分子转变随后与宏观凝胶网络和蛋白质变性相关联，通过流变学和微量差示扫描量热法（μDSC）进行研究。
研究背景：可持续植物基蛋白，如来自鹰嘴豆（CPI）、蚕豆（FPI）、扁豆（LPI）、豌豆（PPI）和大豆（SPI）等脉冲的蛋白，在食品应用中日益重要。脉冲蛋白主要由约15-25%的2S组分（主要为白蛋白）和近70%的11S或7S球蛋白组成。11S组分由六聚体豆球蛋白样蛋白组成，每个亚基包含通过二硫键连接的酸性链和碱性链；7S组分由三聚体豌豆球蛋白和伴豌豆球蛋白样蛋白组成。脉冲蛋白的二级结构主要由β-结构（如平行/反平行β-折叠、β-转角（β-turns）和β-链）和较低比例的α-螺旋（α-helix）组成。理解蛋白质功能特性，尤其是加热和冷却后形成凝胶的能力，对食品应用至关重要。尽管脉冲蛋白热诱导凝胶形成的宏观凝胶化行为已被广泛描述，但对分子水平结构变化、聚集和凝胶化行为之间关系的详细理解仍然有限。热诱导凝胶化机制通常涉及蛋白质去折叠、反应性基团暴露、变性、后续聚集以及通过氢键、疏水和/或静电相互作用形成三维网络。然而，脉冲蛋白高级结构的热诱导变化及其对凝胶形成的贡献尚未完全阐明，尤其是三级结构变化的详细报道尤为稀缺。加热和冷却过程中结构重排发生的特定温度仍不清楚。因此，本研究旨在研究跨多个层级结构的温度依赖性结构转变并表征潜在的凝胶化机制。
研究方法：研究人员采用原位FT-IR光谱监测加热和冷却过程中二级结构的变化，通过特征酰胺I区（1700-1600 cm?1）的温度诱导位移进行分析，并结合二维相关光谱（2D-COS）解析重叠转变的序列。采用原位内源荧光光谱追踪去折叠和聚集过程中三级结构的变化，通过测量色氨酸残基的内源荧光，计算最大发射波长（λmax）和荧光强度比（I350 nm/I330 nm）作为去折叠和复折叠的指标。通过流变学测定凝胶点温度（Tgel）、初始结构化温度（IST）和临界结构化温度（CST）。采用微量差示扫描量热法（μDSC）测定热变性参数，包括起始温度（Tonset）、变性温度（Td）、终止温度（Toffset）和总焓变（ΔHtotal）。脉冲蛋白分离物通过碱性提取法制备，蛋白含量分别为CPI 63%、FPI 77%、LPI 74%、PPI 82%、SPI 76%。所有测量在pH 6.5条件下进行，测量均设三次重复。
研究结果：
3.1 热转变与凝胶化行为：通过μDSC和流变学测定了所有蛋白的热力学参数和流变学参数。CPI和SPI显示两个独立的峰，而FPI、LPI和PPI仅观察到一个峰，这归因于7S和11S球蛋白组分的相对含量及其变性峰的重叠程度。Td范围为LPI的75.9±0.5°C至CPI第二个峰的90.2±0.5°C，顺序为LPI ≤ PPI < FPI < SPI ≤ CPI。ΔHtotal范围为PPI的3.9±0.1 J/g至SPI的8.6±0.2 J/g，顺序为PPI ≤ CPI ≤ FPI ≤ LPI < SPI。Tgel范围为CPI的55.2±5.7°C至SPI的95.1±0.0°C，顺序为CPI < FPI ≤ PPI ≤ LPI ≤ SPI。最终储能模量（G'end）范围为FPI的13±2 Pa至CPI的3791±802 Pa，顺序为FPI ≤ SPI ≤ PPI ≤ LPI < CPI。所有样品的tan δ均远低于1，FPI倾向于较大值。
3.2 热诱导凝胶化过程中的实时FT-IR光谱：加热至79°C时，基线校正FT-IR光谱的吸光度最大值向高波数位移（从~1640至~1670 cm?1）或形成平台。在各自Td附近，平台分裂为两个最大值（~1650 cm?1和~1620 cm?1）和一个最小值（~1640 cm?1）。冷却过程中双峰模式消失，最大值移回低波数。FSD光谱显示，加热过程中分子间β-折叠（~1620 cm?1）峰变得更加明显，而β-转角区域（~1675 cm?1）逐渐保持一致并略有下降。当温度升至Td以上时，分子内β-折叠（~1630 cm?1）相关的峰位移并贡献于分子间β-折叠区域（~1620 cm?1），表明聚集体形成。冷却过程中，FSD光谱显示分子间β-折叠峰强度增加。2D-COS分析表明，加热过程中所有样品的β-转角结构（1675 cm?1）变化发生在分子内β-折叠（1630 cm?1）和α-螺旋/无序结构（1650 cm?1）变化之前。分子内β-折叠（1630 cm?1）变化发生在分子间β-折叠（1620 cm?1）变化之前。冷却过程中，β-转角（1675-1665 cm?1）变化发生在分子间β-折叠（1620 cm?1）和无序结构（1640 cm?1）变化之前。
3.3 稀释蛋白溶液中的内源荧光光谱：25°C时，PPI显示最低初始强度（Imax=27±1.0），FPI显示最短发射波长（λmax=330±0.0 nm），SPI显示最长波长（λmax=337±0.5 nm）。随温度升高，荧光强度降低，发射波长向长波长位移（红移）。冷却过程中，强度部分恢复但未达到初始值，发射波长略微移回短波长（蓝移）但未回到初始位置。根据Tm，去折叠行为顺序为PPI < LPI < FPI ≤ SPI ≤ CPI。冷却过程中I350 nm/I330 nm未恢复到25°C的初始值，表明热变性不可逆且发生了蛋白质-蛋白质聚集。
讨论部分总结：25°C时所有脉冲蛋白样品主要处于天然状态。加热初期（25-79°C），除CPI外大多数样品的G'值无重大变化。CPI的Tgel（55.2±5.7°C）显著低于μDSC测定的Td（73.3±0.3和90.2±0.5°C）和荧光光谱测定的Tm（82.7±0.6°C），表明CPI能够在广泛去折叠发生之前形成凝胶。对于其余蛋白（FPI、LPI、PPI和SPI），Tgel更接近Td。加热破坏了弱分子内氢键和其他非共价相互作用，导致紧凑有序结构（如α-螺旋和分子内β-折叠）重排为无序结构。分子内β-折叠的减少和无序结构的形成伴随蛋白质去折叠。基于2D-COS结果，加热阶段的热诱导凝胶化特征为渐进的结构转变，包括有序二级结构（β-转角~1675 cm?1、α-螺旋~1650 cm?1和分子内β-折叠~1630 cm?1）的减少，表明蛋白质去折叠和分子柔性增加。同时，分子间β-折叠（~1620 cm?1）形成增加，特别是在分子内β-折叠损失之后，表明蛋白质-蛋白质聚集的开始。IST位于Tm的温度范围内，表明在此温度下已有足够数量的去折叠分子可用于诱导从主要分子尺度聚集向更大聚集体的转变。CST明显大于Tm，表明聚集体生长和聚集体间连接仅在蛋白质去折叠态占主导后才达到最大速率。冷却过程中，所有脉冲蛋白凝胶显示G'进一步增加，表明形成了弹性固体状凝胶结构。冷却过程中分子迁移率降低可能通过额外的氢键和疏水相互作用稳定预形成的聚集体，导致网络刚性增加。最终G'end的差异表明凝胶强度不仅由蛋白质去折叠程度或二级结构转变决定，而是由影响网络形成的多种因素共同决定。冷却并未诱导新结构基序的形成，而是促进了部分去折叠蛋白质重组织和交联为更加互联的网络，完成热诱导凝胶化。
结论翻译：鹰嘴豆、蚕豆、扁豆、豌豆和大豆蛋白在热诱导凝胶化过程中表现出不同的温度依赖性结构转变。加热过程中，原位FT-IR和荧光光谱结合流变学和μDSC的实时分析揭示，对于大多数研究的蛋白质（FPI、LPI、PPI和SPI），三级结构主要在流变学参数初始增加之前已发生去折叠。相比之下，CPI表现出更早的流变学响应，IST和Tgel在三级结构去折叠完成之前就已发生。此外，变性温度在二级结构中观察到明显的分子内向分子间β-折叠转变之前就已达到。尽管测量条件（如加热速率或蛋白质浓度）的差异可能影响确切的转变温度，但所提出的结构变化序列与观察数据保持一致。冷却过程中，二级和三级结构重排并行发生，通过分子间β-折叠形成、氢键介导的聚集和疏水相互作用促进最终网络特性的形成，色氨酸残基向聚集体内更疏水的微环境迁移表明了这一点。总体而言，这些结果突出了所研究蛋白质热诱导凝胶化过程中广泛相似的结构重排序列。实时光谱、μDSC和流变学的结合使得能够解析不同结构层级的温度依赖性，通过将分子去折叠和二级结构重排与宏观网络形成中可见的事件相关联，为脉冲蛋白凝胶化机制的潜在事件序列提供了见解。然而，这些结构相似性并未反映在相应凝胶的最终流变学模量中。相反，这些凝胶的储能模量差异很大。这表明凝胶的力学性质可能 additionally 受到聚集体形态差异、不同相互作用类型之间的平衡、非蛋白组分（如CPI中）和蛋白质组成（包括11S/7S比例）等因素的影响。因此，虽然分子水平的变化可能有助于预测相关温度（如凝胶化起始温度），但最终力学性质似乎取决于蛋白质组成、聚集行为和分子间相互作用的更复杂的相互作用，值得进一步研究。
