《PLOS One》：Integrative analysis reveals shared biomarkers and pathways in osteoporosis and rheumatoid arthritis using machine learning and single-cell sequencing
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背景 骨质疏松症（OP）和类风湿关节炎（RA）是常见的慢性疾病，以骨丢失和免疫失调为特征。证据表明RA患者发生OP的风险增加；然而，连接这两种疾病的共享分子机制仍不完全清楚。方法 从基因表达综合数据库（GEO）获取OP和RA的公开批量转录组和单细胞RNA测序（
背景 骨质疏松症（OP）和类风湿关节炎（RA）是常见的慢性疾病，以骨丢失和免疫失调为特征。证据表明RA患者发生OP的风险增加；然而，连接这两种疾病的共享分子机制仍不完全清楚。方法 从基因表达综合数据库（GEO）获取OP和RA的公开批量转录组和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集。应用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与两种疾病相关的共享基因模块。进行功能富集和蛋白质-蛋白质相互作用分析以表征共同生物学通路。使用机器学习算法，包括随机森林（RF）和支持向量机（SVM），识别和验证共享枢纽基因并构建诊断模型。使用CIBERSORT评估免疫细胞浸润，并通过scRNA-seq分析进一步验证枢纽基因的细胞定位。结果 WGCNA识别了OP和RA相关模块之间共享的329个基因，这些基因在肌肉相关过程、细胞因子信号传导和免疫炎症通路中显著富集。RF分析识别了三个共享候选基因：ANO5、IL27RA和CNTN3。其中，ANO5和IL27RA展示了表达证据和文献支持的一致性，而CNTN3作为计算提名候选基因出现，需要谨慎解释和实验验证。基于SVM的模型整合这些基因在OP和RA验证队列中展示了稳健的预测准确性。免疫浸润分析揭示了独特但协调的免疫景观，枢纽基因与T细胞、巨噬细胞、B细胞和浆细胞显示显著相关性。ScRNA-seq分析揭示ANO5主要在巨噬细胞和成纤维细胞中表达，IL27RA主要在T细胞中富集，而CNTN3在OP骨组织和RA滑膜组织的单细胞水平显示最小富集。结论 这项整合生物信息学和机器学习研究识别了OP和RA共享的分子特征和免疫相关机制。ANO5和IL27RA作为连接免疫失调和骨重塑的稳健候选调控因子出现，而CNTN3——尽管通过机器学习识别——由于支持证据有限需要谨慎解释和进一步研究。这些发现为RA相关OP的发病机制提供了新见解，并突出了其共病的潜在生物标志物和治疗靶点。
骨质疏松症（OP）是一种以骨密度降低和结构退化为特征的慢性骨骼疾病，导致脆性增加和骨折风险升高。骨质疏松性骨折主要发生于绝经后女性和老年人，是该人群死亡的常见原因，并构成重大的全球公共卫生负担。OP的发病机制是多因素的，主要涉及骨稳态的破坏，由激素、细胞因子和生长因子的失衡驱动。近期研究已识别了多种骨代谢调节因子和相关信号通路，包括BMP/TGF-β、Wnt/β-catenin、HIF-1α/RANKL/Notch1和JAK-STAT。尽管研究广泛，OP的确切分子机制仍不完全清楚，需要进一步研究。类风湿关节炎（RA）是一种以关节炎症和进行性骨破坏为特征的系统性自身免疫综合征。RA与发病率和死亡率增加相关，不仅源于关节破坏，还源于其全身效应。心血管并发症是预后不良的最重要因素之一，现已被认为是RA患者死亡的主要原因。RA由多种风险因素驱动，不可改变的风险因素包括遗传易感性和性别，可改变的因素包括吸烟、饮食习惯和环境暴露。研究报道RA患者中OP患病率增加，表明自身免疫性疾病和代谢性骨病之间可能存在共享致病机制、重叠免疫通路和趋同治疗策略。大量研究揭示免疫细胞活性、炎症介质和骨重塑动力学在RA和OP的病理生理学中错综复杂地相互关联。RA中的慢性炎症可破坏骨骼重塑稳态，导致RA相关骨丢失。滑膜成纤维细胞和免疫细胞通过促进RANKL依赖性破骨细胞生成和激活炎症通路进一步加剧这一过程，从而加速骨侵蚀并增加骨折风险。因此，研究RA和OP之间的分子联系具有重要的研究价值和治疗意义。在本研究中，研究人员进行了整合生物信息学分析，结合机器学习算法，使用基因表达综合数据库（GEO）的公开数据集识别RA和OP共享的枢纽基因和分子通路。此外，研究人员探索了这些枢纽基因与免疫细胞浸润以及两种疾病相关的关键代谢通路之间的相关性。最后，研究人员使用scRNA-seq分析验证了最重要枢纽基因的表达模式和空间分布。
研究人员开展了以下研究：通过WGCNA分析GSE35959和GSE77298数据集，识别与OP和RA相关的基因模块，共发现329个重叠模块基因。功能富集分析显示这些基因显著富集于肌肉相关过程、细胞因子信号传导和免疫炎症通路。通过随机森林（RF）算法从WGCNA交集基因中筛选枢纽基因，识别了三个共享候选基因：ANO5、IL27RA和CNTN3。使用支持向量机（SVM）构建诊断模型，在OP和RA的训练集和验证集中评估预测性能。通过CIBERSORT评估免疫细胞浸润模式，并分析枢纽基因与免疫细胞亚群的相关性。最后，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析枢纽基因的细胞定位。研究得出以下结论：ANO5和IL27RA是连接免疫失调和骨重塑的稳健候选调控因子，而CNTN3尽管通过机器学习识别，但由于支持证据有限需要谨慎解释。基于SVM的诊断模型在OP和RA验证队列中展示了稳健的预测准确性。免疫浸润分析揭示了两种疾病中独特但协调的免疫景观。ScRNA-seq分析揭示ANO5主要在巨噬细胞和成纤维细胞中表达，IL27RA主要在T细胞中富集。这些发现为RA相关OP的发病机制提供了新见解，并突出了其共病的潜在生物标志物和治疗靶点，为理解免疫-骨骼串扰提供了新的分子候选者。
研究人员为开展本研究用到的主要关键技术方法包括：从GEO数据库获取OP数据集（GSE35959、GSE230665、GSE147287）和RA数据集（GSE77298、GSE93272、GSE200815），其中GSE35959包含5例OP样本和14例健康对照，GSE230665包含12例OP样本和3例对照，GSE147287包含1例OP患者的单细胞数据，GSE77298包含16例RA样本和7例健康对照，GSE93272包含229例RA样本和46例对照，GSE200815包含4例RA患者的单细胞数据；加权基因共表达网络分析（WGCNA）；GO和KEGG功能富集分析；蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建；随机森林（RF）和支持向量机（SVM）机器学习算法；CIBERSORT免疫浸润反卷积分析；单细胞RNA测序数据采用Seurat包进行质控、标准化、高变基因选择、主成分分析（PCA）、K近邻（KNN）图构建、Louvain聚类和均匀流形近似与投影（UMAP）降维可视化，使用SingleR包进行细胞类型自动注释。
研究结果如下：
加权基因共表达网络分析：研究人员对GSE35959和GSE77298数据集进行WGCNA分析，GSE35959的最佳软阈值功率为5，GSE77298为7。在两个数据集中各识别了11个共表达模块。模块-性状相关性分析显示，GSE35959中黑色、灰色60和红色模块与OP相关性最强（r=0.58、0.56和0.68），GSE77298中绿色、红色和棕色模块与RA相关性最高（r=0.65、0.65和0.66）。交叉引用两个数据集的模块基因，识别了329个重叠基因，被认为是参与共享疾病机制的潜在候选基因。
富集分析和PPI网络构建：对329个重叠基因进行GO和KEGG富集分析，结果显示这些基因显著富集于肌肉收缩、肌肉器官发育和骨骼肌收缩调节等肌肉相关生物学过程和通路，以及细胞因子-细胞因子受体相互作用、类风湿关节炎、炎症反应和病毒性心肌炎等免疫和炎症相关通路。GO生物学过程分析还显示这些基因参与多细胞生物过程、发育过程、生物过程调节和免疫系统过程等更广泛的功能类别。通过STRING数据库构建PPI网络（联合交互评分>0.8），网络包含233个节点和375条边，排名前5的显著基因为MYH7、MYH2、IL4、TNNC2和MYH1。
通过随机森林识别和验证潜在共享枢纽基因：RF模型成功构建，误差率在约200棵树后稳定。根据MeanDecreaseGini排名，将OP RF模型（GSE35959）和RA RF模型（GSE77298）的前30个基因取交集，识别了3个共享候选基因：ANO5、IL27RA和CNTN3。
基于SVM构建诊断模型：通过SVM进行ROC曲线分析评估三个共享枢纽基因的诊断效能。在OP模型中，三个基因的AUC值分别为ANO5（AUC=1.000）、IL27RA（AUC=0.833）和CNTN3（AUC=0.889）；在RA模型中，AUC值分别为ANO5（AUC=0.743）、IL27RA（AUC=0.886）和CNTN3（AUC=0.763）。以GSE35959为训练集、GSE230665为外部验证集构建SVM模型（RBF核），OP外部验证的AUC为0.946，PR曲线AUC为0.784。以GSE77298为训练集、GSE93272为外部验证集，RA外部验证的AUC为0.75，训练集AUC为0.986。
免疫细胞浸润与共享枢纽基因的相关性：CIBERSORT分析显示，OP样本中浆细胞轻度升高，细胞毒性CD8?T细胞和活化NK细胞比例相对不变。RA样本显示活化炎症免疫特征，记忆B细胞、M1巨噬细胞和浆细胞显著增加，而初始B细胞、静息树突状细胞、静息肥大细胞、静息NK细胞和静息CD4记忆T细胞显著减少。OP中免疫细胞相关性分析显示活化CD4?记忆T细胞与CD8?T细胞正相关，Tregs与初始B细胞正相关等。RA中免疫细胞相关性网络更密集复杂，活化CD4?记忆T细胞、记忆B细胞和浆细胞之间强正相关。枢纽基因与免疫细胞相关性分析显示，OP数据集中CNTN3表达与静息CD4记忆T细胞和Tregs正相关，IL27RA与记忆B细胞、浆细胞、CD8?T细胞等正相关，ANO5与初始B细胞、静息CD4记忆T细胞等正相关。RA数据集中CNTN3与CD8?T细胞、初始CD4?T细胞等正相关，IL27RA与浆细胞、CD8?T细胞、M0/M1/M2巨噬细胞等正相关，ANO5与CD8?T细胞、初始CD4?T细胞、Tregs、M0/M1巨噬细胞等正相关。
单细胞分析枢纽基因定位：对OP骨组织（GSE147287）和RA滑膜组织（GSE200815）进行scRNA-seq分析。OP数据集注释为13个细胞簇，包括277个组织干细胞、1771个成骨细胞、1315个中性粒细胞、328个单核细胞、879个巨噬细胞、2299个各种祖细胞、161个成纤维细胞、411个T细胞和290个B细胞。RA数据集注释为5个细胞簇，包括258个软骨细胞、691个内皮细胞、1163个成纤维细胞、807个巨噬细胞和428个T细胞。在OP骨组织中，ANO5强表达主要富集于巨噬细胞和成纤维细胞群体，IL27RA表达在T细胞中最高。在RA滑膜组织中，巨噬细胞和成纤维细胞同样显示ANO5最高平均表达水平。CNTN3在两种数据集中所有细胞类型中表达可忽略或不可检测，因此被排除在后续UMAP可视化分析之外。UMAP可视化进一步证实了细胞特异性：OP骨组织中ANO5表达明确定位于巨噬细胞/成纤维细胞谱系，IL27RA主要在T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和CMP中富集；RA滑膜组织中ANO5再次标记巨噬细胞/成纤维细胞簇，IL27RA主要在T细胞和巨噬细胞中富集。这些结果确立巨噬细胞和成纤维细胞是ANO5表达的主要来源，T细胞是IL27RA表达的优势细胞。
讨论部分总结：免疫和炎症紊乱在OP个体中常见，越来越多的证据强调OP和RA之间显著的重叠和协同相互作用。RA作为一种慢性自身免疫性疾病，一直被认为可诱导骨丢失，从而增加OP易感性和骨折及骨骼并发症的发生率。两种疾病均以全身性炎症为关键致病标志，RA可能加剧骨吸收并加速OP进展。糖皮质激素治疗、高龄、女性、久坐生活方式和炎症生物标志物升高等因素已被确定为RA患者OP的风险因素。然而，大多数关联通过临床和血清学观察建立，分子机制仍需进一步研究。传统治疗方式如双膦酸盐可有效增加骨密度但不足以抑制免疫介导的炎症性破骨细胞活性；改善病情抗风湿药（DMARDs）可缓解关节炎症但保留骨量的疗效不一致。多组学研究日益强调整合转录组、表观基因组和蛋白质组数据以解析肌肉骨骼疾病的复杂分子网络的价值。研究人员通过CIBERSORT发现的OP骨组织和RA滑膜组织中协调但独特的免疫景观与这些新兴范式一致。骨免疫学概念——免疫系统和骨骼系统之间的双向串扰——已获得广泛关注，越来越多的证据表明共享炎症通路包括细胞因子信号传导和RANKL介导的破骨细胞生成是炎症性和代谢性骨病共病的基础。研究人员识别ANO5和IL27RA作为连接免疫细胞群体（巨噬细胞、T细胞）与骨相关过程的共享候选基因，与这一骨免疫框架一致，并为未来机制研究提供了特定分子候选者。本研究中，研究人员旨在通过整合生物信息学分析和机器学习算法确定OP和RA是否共享常见分子和遗传机制。最初识别了OP和RA共享的共表达模块，WGCNA衍生模块基因产生329个共享候选基因。值得注意的是，个体基因水平上相对较低的重叠（10%）强调OP和RA之间的共享分子结构主要表现在通路和网络水平——这是复杂多基因疾病中常见的模式——而非个体诊断标志物水平。富集分析显示这些基因与肌肉发育、细胞因子信号传导和炎症通路强烈相关，支持肌肉骨骼功能障碍和慢性炎症作为促进两种疾病骨丢失的共享致病轴的观点。随后采用机器学习方法识别稳健枢纽基因。RF揭示三个共享枢纽基因——ANO5和IL27RA以及作为计算提名候选的CNTN3——展示了强诊断潜力。虽然每个基因作为潜在生物标志物具有价值，但依赖单个基因诊断可能无法完全捕捉RA和OP共病的复杂性。因此，研究人员使用SVM算法构建诊断模型以提高诊断准确性，模型在训练和验证队列中均显示强预测性能。为进一步探索枢纽基因的生物学相关性，研究人员进行了CIBERSORT免疫细胞浸润分析，发现两种疾病中协调免疫调节的证据。RA中活化T细胞、B细胞和浆细胞显示强正相关，与滑膜过度活跃一致。巨噬细胞亚群与活化淋巴细胞呈负相关，提示在炎症和组织修复中的动态作用。枢纽基因ANO5和IL27RA与免疫细胞浸润显著相关。IL27RA与活化T细胞和巨噬细胞相关，提示在调节炎症级联和T细胞分化中的作用。ANO5与巨噬细胞群体显示一致关联，主要在巨噬细胞和成纤维细胞中表达，提示在膜修复或基质相互作用中的潜在作用。ANO5在巨噬细胞和成纤维细胞中高表达，两者均为组织重塑的中心调节者。IL27RA在T细胞中富集，与其已知免疫调节功能一致。相比之下，CNTN3在单细胞水平显示最小富集，提示在主导炎症细胞群体中作用有限，但通过信号传导或结构相互作用的间接参与仍有可能。IL-27RA与糖蛋白130配对形成异二聚体信号复合物，负责转导由其配体IL-27启动的信号。IL27RA编码与gp130一起形成IL-27受体复合物的受体亚基。虽然配体IL-27已被证明在骨稳态中发挥关键作用——促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞生成——但研究人员的数据仅确立IL27RA转录本在特定细胞类型（T细胞和巨噬细胞）中的表达。IL27RA表达是否与OP或RA组织中功能性IL-27信号活性相关无法从当前数据集确定。IL-27通过下调NFATc1、RANK和TREM-2表达及抑制RANK信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。IL27RA也参与RA发展，主要在RA患者T淋巴细胞中表达，其表达与血浆细胞因子、组织TNF和B细胞驱动炎症的滑膜标志物正相关。ANO5是一种钙激活氯通道，在维持细胞内钙稳态中起关键作用，从而调节骨细胞存活、分化和功能。新兴证据表明ANO5对破骨细胞生物学尤为重要，功能缺失突变 disrupt钙离子稳态导致过度内质网应激和CHOP信号通路激活，显著增加破骨细胞凋亡并损害其存活。ANO5在成骨细胞中的功能仍依赖背景且存在争议。据研究人员所知，ANO5尚未在RA滑膜炎或骨侵蚀背景下直接研究，计算发现提示潜在联系值得未来功能探索，但无法从当前数据推断因果或机制作用。CNTN3是一种主要在中枢神经系统表达的神经粘附分子，被机器学习管道识别为计算提名候选基因，但全面文献检索未发现CNTN3与OP或RA中骨稳态、破骨细胞生成、成骨细胞功能或炎症过程直接相关的证据。单细胞数据显示CNTN3在OP骨和RA滑膜组织主要细胞类型中表达可忽略，与免疫亚群的相关性有限。当前证据不支持CNTN3作为OP-RA共享病理的主要介质。尽管整合分析框架具有优势，但需承认若干局限性：研究基于公开转录组数据集，缺乏代表RA-OP共病的数据集限制了因果推断；机器学习 and 单细胞分析增强了发现稳健性，但仍需体外和体内实验验证；组织异质性和外周血、骨、滑膜微环境差异可能影响基因表达模式；训练和验证队列样本量相对较小，不同平台数据集固有异质性可能影响发现普适性；CIBERSORT算法最初为血液转录组反卷积开发，应用于骨和滑膜组织可能引入偏倚，免疫浸润结果应解释为相关性而非确定性；OP训练集样本量较小（GSE35959，n=5例OP）增加过拟合风险并限制统计功效。未来需要更大规模、共病特异性样本和功能实验研究进一步阐明RA和OP之间的免疫-骨骼机制并将这些发现转化为临床应用。
结论翻译：总之，本研究通过整合生物信息学和机器学习方法系统识别了骨质疏松症和类风湿关节炎的共享分子特征。ANO5和IL27RA作为与免疫调节和骨重塑相关的最稳健候选枢纽基因出现，而CNTN3——尽管通过机器学习识别——由于支持证据有限应谨慎解释。总体而言，这些发现为RA和OP之间的免疫-骨骼串扰提供了新见解，并可能促进其共病的改进诊断标志物和靶向治疗策略的开发。
