无需专用捕获装置的双乳液液滴长期成像与多重细菌生长追踪

《PLOS One》：Simple and multiplexed tracking of bacterial growth in double emulsion droplets

　　

基于液滴的微流控技术（droplet-based microfluidics）使研究人员能够通过并行包封单个样本并进行成像，观察复杂生物混合物中的表型异质性（phenotypic heterogeneity）。由于捕获和追踪大量单个液滴的复杂性，观察或量化动态异质性仍具挑战性。当前用于延时成像（time-lapse imaging）的方法需要带有液滴捕获结构（droplet traps）的专用装置，限制了可及性和通量。在此，研究人员利用易获得的材料和软件，展示了一种简单方法，可将大量单个液滴稳定并监测长达12小时。研究人员利用该方法以高通量方式追踪液滴内细菌生长超过6小时。该方法能够追踪液滴内及液滴间生长速率的变化和差异，揭示批式测定（batch assays）中隐藏的生长模式异质性。提高时间依赖性表型分析（time-dependent phenotyping assays）的可负担性和通量有助于推进生物学发现和生物技术创新。

研究背景与问题：基于液滴的微流控（droplet-based microfluidics）可并行包封单个样本并成像，用以观察复杂生物混合物中的表型异质性（phenotypic heterogeneity）。双乳液（double-emulsion, DE）液滴由内水相、油壳和外水相组成，外水相可降低液滴合并风险并允许营养交换，且可借助荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）实现分选。DE液滴可将群体分隔于独立隔室，使低适应度或不常见变体在无竞争条件下生长并被检测；时间序列成像可量化数千个液滴内的时间依赖性过程，揭示平均化或静态成像所掩盖的异质性。但动态追踪仍受液滴漂移、移出视场（field of view, FOV）和焦平面变化制约。现有方法多依赖专用液滴捕获装置，需洁净室制造及连续流或阀门操作，限制可及性和通量；定制追踪算法也增加复现难度和计算时间。因此，需要一种简单、可扩展、低成本且高通量的DE液滴长期成像与追踪流程。

研究开展与意义：研究人员利用现成耗材和开源软件建立简化流程，通过玻璃底皿、增加外缓冲体积及可选琼脂糖包埋稳定大量液滴，实现长达12小时的监测；并以此高通量追踪液滴内细菌生长超过6小时，揭示液滴内和液滴间生长速率差异。该工作降低了时间依赖性表型分析的门槛和成本，提高了DE液滴高通量成像追踪的可及性。

关键技术方法：DE液滴经PDMS微流控芯片生成，四入口分别通入内水相（菌液或无菌LB）、油相（HFE7500+5% PicoSurf）和外水相（PBS+1% Tween-20+2% Pluronic F68）；将液滴注入玻璃底皿中0.25–1%（w/v）低熔点琼脂糖层，旋动使液滴在玻璃界面形成高密度单层，凝固后于37°C延时成像；采用10×明场/荧光，2或5分钟间隔；FIJI进行背景校正，TrackMate的LoG检测和Simple LAP追踪，Python分析。细菌为携带mScarlet1和卡那霉素抗性盒的E. coli，经LB+Kan过夜培养；未涉及临床样本队列。

研究结果：
Use of a glass-bottom dish, increased sample volumes, and agarose help minimize droplet drift（使用玻璃底皿、增加样本体积和琼脂糖有助于减少液滴漂移）：未固定时，液滴在10分钟内（5帧）大量漂出原视场。采用玻璃底皿并增加外缓冲体积可减少蒸发和温度诱导移位；0.25–1%（w/v）琼脂糖包埋后，液滴完整性、焦平面和相对位置在12小时内保持稳定。通过上述固定实验得出，两种流程均可将液滴稳定至12小时。

Fluorescence imaging of DE-droplets reveals differences in cell density（DE液滴荧光成像揭示细胞密度差异）：以光密度（optical density, OD）0.84和9.4培养模拟中、高细胞密度，mScarlet1荧光显示中密度液滴内可分辨单细胞，高密度下单细胞分辨困难。对111个中密度液滴手动计数，观察到的每液滴细胞数（cells per droplet, CPD）分布与泊松期望一致（期望λ=1.44，观察λ=1.29±0.11 SE，95% CI [1.08,1.50]），约90%的单平面检测率可解释轻度偏低。通过该校准实验得出，该流程可精确包封并调节液滴内细菌密度，且近似达到单细胞分辨。

Simplified multiplexed growth tracking reveals sigmoidal growth profiles and heterogeneity in growth rates（简化多重生长追踪揭示S形生长曲线和生长速率异质性）：以OD=1培养生成液滴，平均3.65个细胞/液滴，追踪N=299个液滴6小时，以平均像素强度作为生长代理。多数液滴呈S形生长，平均指数期约125–200分钟，最大平均生长率0.82次倍增/小时出现在T=155分钟；重复视场峰值分别为0.88和0.87次倍增/小时。生长率概率密度函数（probability density function, PDF）显示均值先升后趋零，四分位距（interquartile range, IQR）由早期0.25降至晚期0.20；相近生长率时，45分钟IQR为0.26，245分钟为0.18，前者高44%。按初始生物量指数（biomass index, S₀）三分位分析，高三分位生长率0.95低于低、中三分位的1.30和1.26次倍增/小时（Kruskal–Wallis H=119.6，p=1.1×10^?26，ε²=0.40；S₀与生长率Spearman ρ=?0.61）。单细胞液滴中仍存在异质性：FOV2和FOV3分别有8/29和6/29个液滴的95%置信区间排除均值，单细胞液滴生长率标准差分别为全部液滴的84%、118%和119%。通过上述追踪与分层分析得出，初始载量差异不能解释大部分液滴间生长速率差异，该方法可揭示批式测定中隐藏的生长异质性。

讨论与结论：该方法针对三个目标：维持液滴在视场内位置、降低DE液滴捕获复杂度、避免定制追踪软件并最大化通量。玻璃底皿和大体积缓冲减少蒸发影响，DE液滴的外水相允许可选琼脂糖固定；图像处理和分析采用免费开源软件。局限包括：不追踪单个细胞而是追踪液滴内总生长，像素强度代理限制绝对定量；液滴整体排列使多重处理测试通量仍低，内置分隔最多可并行四条件；无琼脂糖流程易受碰撞或晃动影响；晚期荧光下降与板式OD曲线一致；生长较慢可能与强组成型启动子驱动高拷贝质粒表达mScarlet1有关。通量受视场内可堆积液滴数和各时间点成像视场数限制，已追踪3个视场、1104个液滴、最长6.6小时、5分钟间隔；每次消耗品成本低于2.50美元，四条件时约0.60美元/条件。未来高倍Z-stack成像可能实现单细胞追踪；泊松“贫困”使单实体观察仅利用约14%液滴，主动装载方法可能有用。研究结论翻译：本研究工作回应了对液滴监测方法进一步规模化的需求，这将有助于更深入理解构成群体水平观察的个体生物学和分子行为。研究结果展示了简化方法作为推动液滴微流控技术改进和采用、服务于高通量表型分析的潜力。只有观察构成群体的个体行为，才有望找到满足特定需求的个体样本，并实现对群体更完整的理解。