《Gene Therapy》：High-resolution separation and quantification of dual-AAV drug products by density gradient equilibrium analytical ultracentrifugation
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腺相关病毒（AAV）载体广泛应用于基因治疗，但其有限的包装容量（约4.7 kb）限制了大片段治疗基因的递送。双AAV药物产品（DPs）通过将大转基因拆分至两个载体中提供了一种有前景的解决方案，但引入了精确量化DP中每个载体的关键分析挑战。本研究开发了一种密度梯
腺相关病毒（AAV）载体广泛应用于基因治疗，但其有限的包装容量（约4.7 kb）限制了大片段治疗基因的递送。双AAV药物产品（DPs）通过将大转基因拆分至两个载体中提供了一种有前景的解决方案，但引入了精确量化DP中每个载体的关键分析挑战。本研究开发了一种密度梯度平衡分析超速离心（DGE-AUC）方法，用于高分辨率分离和定量双AAV DPs中高度相似的载体。采用分析质量源于设计（aQbD）结合实验设计（DoE）的方法优化关键方法参数，包括转子和初始盐密度，以最大化分离度和定量准确性。RbCl被确定为最佳密度梯度形成盐，其产生的浅平衡密度梯度能够清晰分离3′和5′ Full AAV衣壳。优化后的方法展现出高精密度、优异的线性、低检测限和定量限，以及在规定的双AAV混合物中的准确定量能力。该方法还可监测载体特异性稳定性以及由于应激导致的单个载体的优先损失，并适用于多载体AAV DPs。这些结果确立了RbCl DGE-AUC作为一种稳健、低样本消耗的方法，用于双AAV DPs的组分特异性表征，并支持新兴多载体基因治疗的分析开发。
**研究背景与问题**
腺相关病毒（AAV）因其可感染多种组织和器官的特性，已成为基因治疗中高效的载体工具，多个获批基因治疗产品涵盖视网膜疾病和神经肌肉疾病等适应症。然而，AAV的包装容量限制在约4.7 kb，无法在单一载体中递送大基因。多种遗传疾病涉及基因超出该阈值，包括杜氏肌营养不良症、A型血友病、视网膜变性和耳聋相关疾病。其他递送系统如脂质纳米颗粒虽可携带较大基因，但存在缺乏组织特异性、免疫原性和毒性等挑战。双AAV策略通过将大转基因拆分至两个独立载体中，分别经三质粒转染系统生产、纯化后按定义比例共配制为药物产品（DP），实现靶细胞共感染，载体基因组通过同源重组产生成熟mRNA。近期FDA批准了首个双AAV基因治疗药物Otarmeni，凸显了混合AAV产品的临床相关性及对单个衣壳表征分析方法的需求。
对携带目标基因组的双AAV进行全面的分析表征对于确保DP的效力和安全性至关重要。除表征杂质（如空衣壳或部分填充衣壳）外，确保DP中每种完全包装AAV衣壳的正确比例也十分关键。此外，评估DP中两种AAV在储存条件下的稳定性至关重要，因为应激导致的任一AAV优先损失可能影响DP效力。现有分析技术包括定性聚合酶链反应（PCR）、微滴数字PCR、酶联免疫吸附测定和分析超速离心（AUC），但这些方法可能无法完全捕捉多载体混合物的复杂性，也难以提供同一制剂中高度相似载体种类的组分特异性定量。电荷检测质谱和的质量光度法可区分空、部分和完全衣壳，但尚无文献强调其用于混合AAV样品的适用性，且这些新技术的可及性有限。因此，亟需更稳健的分析工具来可靠分离和定量双AAV及多AAV制剂中的单个载体。本研究引入了一种独特方法以填补这些分析空白，支持靶向大基因组基因治疗的推进。
密度梯度平衡分析超速离心（DGE-AUC）基于浮力密度分离AAV种类，与主要报告流体力学行为的沉降速度AUC不同，DGE-AUC可利用基因组内容和浮力密度的微小差异。研究人员旨在开发一种能够分离携带相似载荷的AAV衣壳的稳健方法。常规氯化铯（CsCl）DGE-AUC无法充分分离双AAV样品中的Full衣壳（即3′ Full和5′ Full峰）。因此，研究人员评估了多种梯度形成盐，假设形成浅密度梯度的盐能更好地分离双AAV载体，并确定氯化铷（RbCl）为有效分离两种Full AAV衣壳的盐。通过aQbD结合DoE方法进一步优化转子速度和初始盐密度等实验变量，以促进双AAV DP中Full载体比例的准确测定。随后使用基因组滴度比从20:80至80:20（3′ Full:5′ Full）的双AAV混合样品评估优化方法的性能，DGE-AUC测量结果与预期值高度一致，偏差小于3%，证明其适用于DP中双AAV的准确定量。该研究强调了DGE-AUC在分析病毒治疗药物方面的巨大潜力，是首个专为双AAV DPs开发的DGE-AUC方法。
**关键技术方法**
研究人员使用Regeneron Pharmaceuticals病毒生产核心（VPC）通过HEK293T细胞三质粒转染生产、经亲和色谱和离子交换色谱纯化的两种AAV样品（3′和5′），基因组长度分别为4216和4644碱基对。采用aQbD与DoE框架进行双因素两水平全因子筛选，优化转子速度（34,000–38,000 rpm）和RbCl起始密度（1.38–1.39 g/mL）。DGE-AUC实验在Optima AUC中20 °C条件下进行，监测230、260和280 nm吸收。数据分析使用自定义MATLAB脚本进行基线扣除和高斯函数峰拟合。方法验证涵盖精密度、线性、检测限和定量限及准确性评估。
**研究结果**
DGE-AUC实验：研究人员首先用SV-AUC检测DP样品，发现因两种Full衣壳沉降系数差异小，SV-AUC无法分离。使用CsCl的DGE-AUC能分离两个Full峰但分辨率低（约0.7）。基于分辨率与密度梯度比例常数βeff成反比的原理，研究人员评估了CsCl、RbCl、RbBr和CsFo的分辨能力，RbCl提供最大分离度和最高分辨率（约1.5），CsFo虽分离良好但吸光度信号丢失提示AAV可能失稳，故选择RbCl作为最佳梯度形成盐。
精细调节RbCl密度范围：起始密度是关键决定因素，较高起始密度使AAV峰向弯月面移动，较低密度使峰向底部移动。1.38–1.39 g/mL范围使两个Full峰均处于最佳定量窗口内，故选该范围进一步优化。
优化AAV载量：输入浓度调整为OD230 0.05–0.2，OD范围0.1–0.2给出高分辨率（约1.7），较低和较高载量分辨率均降低（约1.3–1.4）。后续实验固定AAV载量相当于0.15 OD230。
转子速度：基于30,000–48,000 rpm范围的评估，34,000–38,000 rpm提供良好分离且可重复的峰形，超过40,000 rpm导致超离心泄漏等操作问题。
DoE数据收集：在JMP Pro 17中生成自定义DoE，评估RbCl起始密度和转子速度对DGE-AUC性能的影响，共12次实验。
重复性验证：在优化条件（37,300 rpm，RbCl密度1.3856 g/mL）下六次重复运行，3′ Full和5′ Full峰间分辨率为1.63 ± 0.01，与JMP预测值1.62 ± 0.02一致。%5′ Full和%3′ Full的相对标准偏差分别为1.1%和0.8%，峰中点距预期值仅0.005 cm。
检测限和定量限测定：线性评估涵盖三种模型——总峰面积、5′ Full峰面积和3′ Full峰面积对OD230，在0.0495至0.18 OD230范围内均呈强线性相关（R2 = 0.98）。总峰面积模型LOD为1.35E11 vg，LOQ为4.09E11 vg。
不同比例DP样品中3′ Full和5′ Full的准确定量：分析20:80、40:60、50:50、60:40和80:20的3′ Full:5′ Full混合物，测得比例与已知预期比例密切匹配，两种衣壳的相关系数均超过0.99，峰形和位置在不同混合物组成间保持一致。
热应激双AAV混合物的DGE-AUC测定：37 °C热应激14天后，SV-AUC显示Full衣壳从76.1%降至62.2%，部分和空衣壳分别从2.2%增至7.3%和从21.7%增至30.6%。DGE-AUC显示%3′ Full:%5′ Full比值从T0的52.9%:47.1%偏移至应激后的40.1%:59.9%，表明3′ Full种类优先耗竭，与包封较大基因组的衣壳优先失稳一致。
**讨论与结论**
双AAV和多AAV药物产品作为治疗超长缺陷基因遗传疾病的有前景基因疗法，提出了独特的分析挑战，因为单个载体可能在基因组长度、浮力密度和流体力学行为上仅有微小差异，使大多数分析技术难以实现分离和准确定量。研究人员应用aQbD框架开发并优化了DGE-AUC方法，能够分离和定量基因组大小高度相似（约400核苷酸差异）的两种AAV载体。与无法分离两种Full衣壳的SV-AUC不同，优化后的DGE-AUC方法实现了近基线分离和可重复的准确定量，即使在一种载体大量过量的DP样品中亦然。线性评估强调了该技术的低样本消耗需求。本研究的关键分析发现是RbCl作为梯度形成盐的优越分辨能力，与常用CsCl相比，RbCl产生更浅的密度梯度，扩大了密度略有不同的AAV衣壳间的空间分离。该增强的分辨能力不仅对分离双AAV DP中的两种Full衣壳至关重要，也已成功应用于分离代表性三AAV混合物中的各物种。RbCl还具有相对CsCl降低健康和环境风险的实际优势。该方法最重要的能力或许是监测混合AAV制备中各组分的稳定性变化，热应激双AAV DP样品显示两种Full衣壳相对比例明显偏移，表明一种载体在加速应激条件下优先损失。这种详细程度用常规基因组含量测定方法难以获得。总之，本研究建立了优化DGE-AUC方法作为混合载体AAV药物产品的稳健分析工具，通过将浅密度梯度形成盐的机制原理与aQbD优化策略相结合，实现了高分辨率分离、准确定量和监测载体特异性稳定性的能力，填补了关键分析空白，支持新兴混合载体基因治疗产品的严格表征。
