膦酰二肼一锅法合成对称与非对称酮连氮及醛连氮：X射线结构表征、抗菌筛选、分子对接与分子动力学模拟研究

《Scientific Reports》：Synthesis, X-ray structural characterization, antimicrobial screening, molecular docking, and molecular dynamics simulations of symmetrical and asymmetrical azines

　　

研究人员开发了一种便捷、环境友好且高效的一锅法方案，通过酮和/或醛与膦酰二肼（phosphonic dihydrazide）在回流乙醇中缩合，合成了三十种对称与非对称酮连氮（ketazines）和醛连氮（aldazines）衍生物。衍生物5j、6a-b、7a-c和8b为新型连氮化合物。该方法条件温和，产率良好至优异，并可耐受多种芳香族和杂芳香族底物。通过1H和13C NMR波谱、元素分析以及对选定衍生物的单晶X射线衍射完成了合成连氮化合物的结构解析，确认了其几何构型和分子构象。研究人员评价了三十种连氮衍生物对革兰阳性菌和革兰阴性菌以及酵母菌和丝状真菌的抗菌活性。多种化合物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）表现出选择性活性，而对革兰阴性菌株的活性有限。最低抑菌浓度（MIC）值一般在200至500 μg/mL范围内，表明抗菌效力中等。研究结果为连氮衍生物的构效关系提供了见解，并突出了芳香取代模式对生物活性的影响。本研究采用分子对接、60 ns分子动力学（MD）模拟和MM/GBSA结合自由能计算，考察了化合物5e对金黄色葡萄球菌二氢叶酸还原酶（DHFR）的作用。DHFR-5e复合物表现出优于无配体（apo）体系的稳定性（RMSD：1.00 ± 0.14 ?），该复合物具有良好的热力学稳定性（ΔGbind = ? 23.53 ± 0.27 kcal/mol），主要由范德华相互作用驱动。化合物5e是抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（anti-MRSA）药物开发中有前景的先导化合物。总体而言，本研究提出了一种操作简单且通用性强的连氮合成方法，并对其抗菌潜力进行了初步评估。

连氮类化合物（azines，R₂C=N–N=CR₂）是一类重要的含氮化合物，其结构特征源于酮或醛与肼的缩合反应，在药物、农用化学品和材料科学等领域具有实用价值，可作为抗癌、抗胆碱酯酶、抗糖尿病、抗菌及治疗阿尔茨海默病等活性化合物的中间体，还可作为金属配位化学中的配体。连氮化合物具有两个由N–N单键连接的偶氮甲碱（C=N）官能团，其构象可与1,3-丁二烯类比，存在s-trans和s-cisoidal gauche构象，并可能发生E/Z异构化。现有连氮合成方法包括醇与肼在镍、钌金属配合物催化下反应，腙类在FeCl₃中回流，羰基化合物与Cs₂CO₃分解N-对甲苯磺酰腙，肟在CuI催化下转化，以及无溶剂研磨等多种途径，但部分方法存在反应条件复杂、回流时间长、催化剂昂贵或选择性不足等问题。膦酰二肼的使用可提高反应速率、改善产率、缩短反应时间，并具有良好选择性和温和条件，可减少副反应，且易得、成本低。基于此，研究人员以膦酰二肼[(NH₂-NH)₂-P(=O)H]作为连氮（N-N）部分的来源，合成了一系列酮连氮和醛连氮衍生物，并评价其作为抗菌剂的潜力。

研究人员合成了对称与非对称酮连氮和醛连氮衍生物3a-l、5a-k、6a、6b、7a-c和8a-c。对称酮连氮3a-l由相应酮1与膦酰二肼2（2:1）在乙醇中回流3 h制得，产率良好至优异；其¹H NMR谱在δ 2.23–2.50 ppm出现积分相当于六个质子的单峰，归属为两个甲基，¹³C NMR谱显示全部预期碳信号并证实无羰基，质谱显示相应分子离子峰。对称醛连氮5a-k由相应醛4与膦酰二肼2（2:1）在乙醇中回流3 h制得，产率良好至优异；其¹H NMR谱在δ 8.07–9.2 ppm出现积分相当于2个质子的单峰，归属为两个偶氮甲碱（CH=N-）质子，IR和¹³C NMR谱证实无羰基。非对称酮连氮和醛连氮由醛与酮、两种不同酮、两种不同醛分别与膦酰二肼2反应制得。元素分析和波谱数据阐明了这些化合物的结构，例如化合物6b的¹H NMR显示δ 8.47 ppm和2.96 ppm两个单峰，分别归属为偶氮甲碱质子和三个甲基（Me及Me₂N），¹³C NMR显示12个信号；化合物7a的¹H NMR显示δ 7.82、7.77、7.62和7.23 ppm的芳香质子信号及δ 2.32、2.23和2.22 ppm的三个甲基单峰，¹³C NMR显示11个信号并证实无羰基。研究人员提出了可能的反应机理：化合物2中氨基氮对1或4的羰基进行亲核进攻生成中间体A，其与另一分子1或4反应生成环状中间体B，B水解生成连氮3、5、6、7、8及副产物肼基次膦酸。

单晶X射线衍射研究显示，3c和3e的晶体结构中两个分子均为E构型。3c中溴苯基与相连的亚乙基肼基之间的二面角分别为21.09(20)°和27.55(17)°，两个苯环间二面角为70.41°，肼基C10-N2-N-C7扭转角为123.49(28)°；3e分子为平面结构，两个乙基苯酚基团间二面角为5.13(14)°，肼基C10-N2-N1-C7扭转角为177.81(26)°，存在分子内O-H―N氢键，O1-H1―N1和O2-H2―N2键角分别为146.3°和146.9°，O1―N1和O2―N2距离分别为2.536(3)?和2.542(3)?。化合物5c和5e分别采用1E和2E构型；5c分子在晶体中为平面结构，C1-N1-N1-C1扭转角为180°；5e晶体结构含两种构象略有差异的独立分子，一种分子中苯环间二面角为29.95(29)°，另一种为26.05(31)°，两分子中肼基扭转角分别为168.85(66)°和168.69(64)°，甲氧基与所连环共平面，C_methyl-O-C_phenyl-C_phenyl扭转角在171.2°–178.6°范围内。

抗菌活性评价显示，三十种化合物对五种微生物（包括细菌和真菌）进行了测试。3a、3b、3k、3L、5a、5j、5k、6a、6b、7b、7c、8a和8b对金黄色葡萄球菌有活性，除8a对革兰阴性菌大肠杆菌（E. coli）有活性外，其余对革兰阴性菌无活性；这些化合物对酵母白色念珠菌（C. albicans）有活性。3c、3d、3e和3f对大肠杆菌和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）有活性，3c对白色念珠菌有抗真菌活性；3d、3e和3f对金黄色葡萄球菌或真菌无作用。3g、3h和5b仅影响革兰阳性金黄色葡萄球菌。5c对革兰阴性和革兰阳性菌均有活性，抑菌圈在1.2至2.0 cm范围内，无抗真菌活性。5f影响大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌，对金黄色葡萄球菌抑菌圈最大达2.0 cm。5d对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌有活性，但对金黄色葡萄球菌无活性。所有受试化合物对丝状真菌土曲霉（A. terreus）均无活性；3k、3L、5a、5b、5j、5k、6a、7b、7c、8a和8b未显示抗真菌活性。MIC测定显示，多数MIC值不低于200 μg/mL，大多在300至500 μg/mL之间，药理学前景有限；最佳MIC值由5e对金黄色葡萄球菌及3a和3b对白色念珠菌取得，均为200 μg/mL。研究人员讨论了含氮和氨基的多环化合物常表现强抗菌活性，其电荷、亲脂性和与微生物细胞组分的相互作用影响活性，主要机制涉及与微生物细胞膜相互作用及破坏必需生物功能；还讨论了连氮衍生物缺乏抗真菌活性的可能原因，包括真菌细胞壁通透性差、缺乏药效团核心、酶结合弱等，并指出卤素取代、引入喹啉骨架和金属配合物可能改善抗真菌活性。研究人员强调，尽管5e对金黄色葡萄球菌DHFR显示有利的预测相互作用（MM/GBSA结合自由能?23.53 ± 0.27 kcal/mol），其实验MIC为200 μg/mL，计算亲和力不应直接等同于全细胞抗菌效力，分子对接和MD描述的是特定计算模型下的配体-靶标相互作用，未考虑细菌包膜穿透、胞内蓄积、主动外排、代谢转化或可能的脱靶相互作用，且对DHFR的良好结合不能证明DHFR是导致观察到的抗菌表型的主要胞内靶标。研究人员还指出，观察到的构效关系可能受芳香取代基的物理化学效应影响，甲氧基可增加亲脂性同时提供氢键受体，羟基增加极性和氢键能力，卤素取代可改变亲脂性和电子分布，杂芳环可引入极性、π-堆积能力和氢键相互作用的变化；对革兰阳性金黄色葡萄球菌的优先活性可能部分反映细胞包膜结构和通透性差异，但外排和胞内靶标可及性也可能起作用，这些构效关系观察应视为初步结果，需通过物理化学测量、通透性研究、靶标酶试验和系统类似物开发加以确认。抗真菌结果显示白色念珠菌与土曲霉之间存在明显差异，可能与酵母和丝状真菌在细胞包膜结构、膜组成、转运机制、胞内代谢和靶标可及性方面的差异有关；含甲氧基衍生物对白色念珠菌的活性提示疏水性与氢键受体能力之间的适当平衡可能有助于抗真菌活性，但现有数据集有限，无法确定单一取代基的作用；对土曲霉完全无活性表明当前连氮骨架可能缺乏对该丝状真菌有效活性所需的物理化学或靶标特异性特征。

分子动力学与系统稳定性研究显示，研究人员选择化合物5e进行完整MD模拟和MM/GBSA分析，因其在实验筛选中表现出最有利的总体抗菌特征，包括对金黄色葡萄球菌最低MIC值（200 μg/mL）、最大抑菌圈（2.0 cm），以及对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的额外活性；其对称的3,4-二甲氧基苯基取代醛连氮骨架也为醛连氮亚系列提供了化学上具有代表性且结构信息丰富的模型。DHFR-apo和DHFR-5e复合物体系所有帧的平均RMSD值分别为1.17 ± 0.17 ?和1.00 ± 0.14 ?，表明5e结合蛋白复合物较apo体系 adopted 相对更稳定的构象。DHFR-apo和DHFR-5e复合物的平均RMSF值分别为0.94 ± 0.40 ?和0.90 ± 0.37 ?，表明5e结合蛋白复合物残基波动较低。平均Rg值分别为15.66 ± 0.10 ?（DHFR-apo）和15.50 ± 0.07 ?（DHFR-5e复合物），表明5e与所研究受体形成高度稳定的结构。平均SASA值分别为8435.76 ?2（DHFR-apo）和8429.31 ?2（DHFR-5e复合物）；SASA结果与RMSD、RMSF和Rg观察共同证实5e复合物体系在所研究受体催化结构域结合位点内保持完整。

基于结合自由能计算的结合相互作用机制研究显示，MM/GBSA计算的总结合自由能（ΔG_bind）为?23.53 ± 0.27 kcal/mol，表明有利且稳定的复合物形成。贡献项分析显示，相互作用主要由强范德华贡献（ΔE_vdW = ?34.34 ± 0.28 kcal/mol）主导，表明配体与酶活性位点之间存在广泛的疏水堆积和形状互补；静电贡献（ΔE_elec = ?6.73 ± 0.48 kcal/mol）也有利但明显较小，表明离子或氢键相互作用虽参与结合但非主要驱动力；净气相能量（ΔG_gas = ?41.07 ± 0.49 kcal/mol）高度有利，但部分被正溶剂化自由能（ΔG_solv = 17.54 ± 0.40 kcal/mol）抵消，反映复合物形成时配体和结合口袋极性基团去溶剂化的能量惩罚。总体数据表明5e与DHFR的结合主要由非极性范德华相互作用驱动，静电贡献适中且部分被不利的去溶剂化效应抵消。研究人员强调，MM/GBSA在固定力场和溶剂化模型下提供的是同类系列内结合有利性的相对定性估计，计算ΔG_bind值不应解释为实验抑制常数（Ki）、IC50或MIC值的直接定量预测；ΔG_bind绝对大小对力场、溶剂化模型、介电常数和显式熵项缺失敏感，因此比较最有意义的是密切相关的类似物之间而非不同靶标或试验条件之间；本研究中MM/GBSA结果仅用于支持5e与DHFR形成热力学有利复合物且主要由范德华接触驱动的解释，并指导关键相互作用残基的识别。

配体结合关键残基识别研究显示，基于残基能量分解，5e与DHFR的结合由活性位点分布的网络有利相互作用稳定。最大总贡献来自LEU34，总能量为?15.13 kcal/mol，主要由强范德华接触（ΔE_vdw = ?8.776 kcal/mol）及中等静电组分补充；LEU40（?11.926 kcal/mol）、LEU10（?11.061 kcal/mol）、LYS45（?11.478 kcal/mol）和THR46（?11.44 kcal/mol）也对总结合有显著贡献，强调疏水和极性相互作用在稳定配体-受体复合物中的重要性；VAL13、VAL41和LEU2的总能量也超过?8.9 kcal/mol，范德华项主导其贡献；相反，LEU20、LEU24、VAL31、LYS32、LEU54和GLY37的总能量相对适中（?2.635至?0.3 kcal/mol），表明其作用较小或更中性。总体数据突出表明5e的结合亲和力源于多个活性位点残基的累积贡献，疏水堆积（范德华）起主导作用，静电相互作用在关键位置提供补充稳定。

配体-残基相互作用网络谱研究显示，化合物5e占据DHFR催化活性位点，与Ser 49形成稳固氢键，并与多个疏水残基包括Leu 20、Ile 50、Leu 28、Lys 32和Leu 54发生π-烷基相互作用。

主成分分析（PCA）研究显示，PCA图揭示显著子空间内沿两个主成分存在明显而复杂的构象波，apo蛋白和5e复合物体系在运动上呈现可辨分离；因此，60 ns MD轨迹得出的特征向量在体系间差异显著，反映蛋白运动多样性；鉴于apo体系显示比5e复合物体系更大的原子波动，配体与活性位点结合可能诱导5e复合物体系的构象动力学，随后在主要成分中反映为运动波。

动力学交叉相关矩阵（DCCM）分析研究显示，DCCM分析揭示5e与DHFR结合诱导蛋白内结构动力学，导致相关运动变化所反映的构象改变。DHFR蛋白中观察到明显相关区域，特别是在残基0–60和残基80–100，这些区域代表受体最具动态性的区域，包含大多数疏水活性位点残基；所有评估体系主要表现残基间相关运动而非反相关运动。

自由能景观（FEL）分析研究显示，apo体系呈现相对宽泛且分散的能量景观，具有多个浅极小值，反映更大构象灵活性和多个能量可及状态的存在；相反，DHFR-5e复合物显示更集中且更深的能量盆地，表明配体结合限制构象采样并将蛋白稳定于更窄、能量更有利的构象空间区域；复合物体系能量分散降低与先前报道的较低RMSD、RMSF和Rg值一致，进一步支持5e结合后稳定DHFR结构；这些自由能景观共同表明配体结合诱导构象限制并增强DHFR活性位点的热力学稳定性。

概率密度函数（PDF）分析研究显示，DHFR-5e复合物的RMSD分布呈窄而明确的峰，中心约在1.0–1.2 ?，表明复合物在模拟轨迹中保持稳定构象，与参考结构偏差极小；分布窄度反映结构波动有限，与紧密堆积且稳定的蛋白-配体相互作用一致；RoG分布呈尖峰，中心约在15.5–15.6 ?，表明复合物保持一致的紧凑性，随时间变化很小；两种分布的单峰和窄特性表明DHFR-5e复合物在60 ns MD模拟期间实现构象稳定，未发生显著去折叠或大规模结构转变，证实复合物的结构完整性和动态稳定性。

研究方法方面，研究人员采用¹H和¹³C NMR波谱（500 MHz和125 MHz，DMSO-d₆，TMS内标）、元素分析、红外光谱（KBr压片）进行结构表征；采用Agilent SuperNova Dual Atlas衍射仪（Mo辐射）收集单晶X射线衍射数据；采用微量稀释法等测定MIC并测量抑菌圈评价抗菌活性；采用分子对接、60 ns分子动力学模拟、MM/GBSA结合自由能计算、残基能量分解、PCA、DCCM、FEL和PDF分析进行计算机模拟研究。膦酰二肼按文献方法制备。

结论部分译文：研究人员开发了一种便捷、环境友好且高效的一锅法方案，通过酮和/或醛与膦酰二肼在回流乙醇中缩合，合成了三十种对称与非对称酮连氮和醛连氮衍生物。衍生物5j、6a-b、7a-c和8b为新型连氮化合物。该方法条件温和，产率良好至优异，并可耐受多种芳香族和杂芳香族底物。通过¹H和¹³C NMR波谱、元素分析以及对选定衍生物的单晶X射线衍射完成了合成连氮化合物的结构解析，确认了其几何构型和分子构象。研究人员评价了三十种连氮衍生物对革兰阳性菌和革兰阴性菌以及酵母菌和丝状真菌的抗菌活性。多种化合物对金黄色葡萄球菌表现出选择性活性，而对革兰阴性菌株的活性有限。MIC值一般在200至500 μg/mL范围内，表明抗菌效力中等。研究结果为连氮衍生物的构效关系提供了见解，并突出了芳香取代模式对生物活性的影响。本研究采用分子对接、60 ns MD模拟和MM/GBSA结合自由能计算，考察了化合物5e对金黄色葡萄球菌DHFR的作用。DHFR-5e复合物表现出优于apo体系的稳定性（RMSD：1.00 ± 0.14 ?），该复合物具有良好的热力学稳定性（ΔG_bind = ? 23.53 ± 0.27 kcal/mol），主要由范德华相互作用驱动。化合物5e是抗MRSA药物开发中有前景的先导化合物。总体而言，本研究提出了一种操作简单且通用性强的连氮合成方法，并对其抗菌潜力进行了初步评估。