《PLOS One》：Identification and validation of biomarkers associated with mitochondrial dynamics dysfunction in Parkinson’s disease based on GEO datasets
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背景 帕金森病（PD）是第二常见的神经退行性疾病，其特征为病因不明且缺乏特异性早期诊断生物标志物。本研究旨在探究与PD中线粒体动力学（MD）功能障碍相关的新型生物标志物。方法 整合来自基因表达综合数据库（GEO）的转录组数据（训练集：GSE6613，n = 7
背景 帕金森病（PD）是第二常见的神经退行性疾病，其特征为病因不明且缺乏特异性早期诊断生物标志物。本研究旨在探究与PD中线粒体动力学（MD）功能障碍相关的新型生物标志物。方法 整合来自基因表达综合数据库（GEO）的转录组数据（训练集：GSE6613，n = 72；验证集：GSE99039，n = 438）及23个MD相关基因（MDRGs）。使用limma包筛选差异表达基因。采用三种机器学习算法（随机森林、支持向量机和广义线性模型）构建诊断模型。通过特征重要性分析鉴定关键候选生物标志物，并在临床样本中通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）进行初步验证。随后进行功能富集、免疫浸润及化合物预测分析。结果 半胱氨酰白三烯受体2（CYSLTR2）和α-生育酚转移蛋白样基因（TTPAL）被鉴定为与MDRG评分相关的生物标志物。在验证集中，CYSLTR2显著下调（log2FC = ?1.25，P < 0.001）并参与神经活性配体-受体相互作用。相反，TTPAL显著上调（log2FC = 1.52，P < 0.001）并与致病性大肠杆菌感染通路相关。免疫分析揭示了六种差异浸润的免疫细胞类型。值得注意的是，TTPAL表达与角质形成细胞呈正相关（cor = 0.30，P = 0.031）。预测了四种潜在治疗化合物。RT-qPCR提示PD患者中CYSLTR2下调及TTPAL上调（P < 0.0001）。结论 本研究鉴定出CYSLTR2和TTPAL作为与PD中MD功能障碍相关的新型候选生物标志物，为机制研究和治疗探索提供了新靶点。
研究背景：帕金森病（PD）是仅次于阿尔茨海默病的第二大常见神经退行性疾病，随着人口老龄化其全球疾病负担显著增加。PD以运动症状为主要特征，包括运动迟缓、静止性震颤、肌强直、姿势不稳和步态障碍，这些症状严重损害患者生活质量并构成PD的核心临床诊断标准。非运动症状如嗅觉功能障碍和便秘常先于运动症状出现，可能是PD早期甚至临床前期的指标。PD病因复杂且多因素交织，涉及遗传易感性、环境暴露和衰老相关因素，神经炎症在PD进展中的作用也日益受到关注。线粒体被誉为细胞的"能量工厂"，对神经元功能和存活不可或缺。线粒体动力学（MD）包括融合、分裂和线粒体运输等过程，与线粒体生物发生和线粒体自噬协同维持线粒体周转。MD失调可导致线粒体结构和功能异常，进而使细胞状态向疾病易感表型转变。因此，MD已成为线粒体质量控制的核心。越来越多的证据证实MD在神经系统疾病（如阿尔茨海默病、亨廷顿病和PD）发病机制中的关键作用。值得注意的是，MD失调驱动的碎片化和功能损伤阻碍了自噬机制对线粒体的识别和清除，从而加剧线粒体自噬缺陷，这种线粒体自噬损伤已被证明在PD多巴胺能神经元丢失中发挥主要作用，导致线粒体功能障碍被广泛认为是PD的关键病理标志。然而，MD功能障碍在PD发生和进展中的精确机制基础仍有待阐明。由于病因和发病机制的复杂性，目前PD的临床诊断主要依赖临床表现。在现有影像学方法中，[18F]DOPA正电子发射断层扫描（PET）可表征纹状体多巴胺能功能减退，但PET的技术复杂性和高成本使其难以应用于人群早期筛查。然而，当典型运动表现出现并确立PD诊断时，现有治疗只能缓解症状而无法阻止或逆转疾病进展。因此，迫切需要用于PD早期识别的分子生物标志物，以便在明显运动表现出现之前进行及时干预。值得注意的是，高通量和多组学技术通过基因组水平的核心病理级联靶向、线粒体分子紊乱表征以及线粒体相关疾病分子诊断的改进，推动了神经退行性疾病的精准医学和机制驱动药物发现。本研究通过整合分析GEO数据集和MD相关基因（MDRGs），旨在鉴定与PD中MD功能障碍相关的新型生物标志物并系统阐明其潜在调控机制，为PD病理机制提供新见解，并为机制研究和治疗探索突出新靶点。
研究方法：研究人员开展了以下研究：从GEO数据库检索转录组数据集（2025年6月15日），GSE6613作为训练集（GPL96平台，50例PD患者和22例健康对照的全血样本），GSE99039作为完全独立的外部验证队列（GPL570平台，205例PD患者和233例健康对照的外周血样本）。从MitoCarta 3.0数据库获得23个MDRGs。使用limma包进行差异表达分析（P < 0.05，|log2FC| > 0.5），通过GSVA算法将转录组矩阵转换为评分矩阵，以中位GSVA评分将PD样本分为高分组和低分组，筛选MDRGs相关DEGs，与PD vs 对照的DEGs取交集获得候选基因。对候选基因进行GO和KEGG富集分析及PPI网络构建。采用随机森林（RF）、支持向量机（SVM）和广义线性模型（GLM）进行第一轮建模，通过DALEX包进行残差分析和置换变量重要性评估，选择残差最小的RF模型筛选前10个候选生物标志物，并在训练集和验证集中验证表达趋势一致性。基于最终鉴定的生物标志物进行第二轮建模，通过ROC曲线评估分类性能，并进行5折分层交叉验证。构建列线图并通过校准曲线、ROC曲线和决策曲线分析（DCA）评估预测性能。对生物标志物进行GSEA、免疫细胞浸润分析（xCell算法）、转录因子-微小RNA-生物标志物调控网络构建、化合物预测及分子对接分析。通过RT-qPCR在临床样本（5例PD患者和5例健康对照的全血样本，来自南京市第二医院）中验证生物标志物表达。研究方法涉及的关键技术包括：GEO数据集整合分析、GSVA算法、三种机器学习算法（RF、SVM、GLM）建模、GSEA、xCell免疫浸润分析、分子对接（CB-Dock2平台）及RT-qPCR验证。
研究结果：
3.1 PD中MD相关候选基因的鉴定：从GSE6613数据集获得221个DEGs（121个上调，100个下调）。PD样本的MDRG评分低于对照样本。以中位MDRG评分（?0.08153）将PD样本分为高分组和低分组（各25例），获得381个MDRGs相关DEGs。将221个DEGs与381个MDRGs相关DEGs取交集，获得17个候选基因。
3.2 候选基因的功能和相互作用特征：GO富集分析显示候选基因主要富集于线粒体RNA聚合酶转录延伸（GO:0006392）、O-酰基转移酶活性（GO:0008374）和上皮细胞中聚合免疫球蛋白受体介导的免疫球蛋白转运（GO:0002415）。KEGG富集分析显示主要富集于类固醇生物合成（hsa00100）、萜烯骨架生物合成（hsa00900）和α-亚麻酸代谢（hsa00592）。PPI网络显示7个候选基因编码蛋白（RAB17、RIPK4、C2CD2、TEFM、TRMT13、PLA2G4C和SOAT2）存在相互作用，鉴定出4个相互作用对。
3.3 PD中MD功能障碍相关生物标志物：RF模型残差最小，被选为最优模型。基于RF模型的特征重要性评分，前10个基因（PDSS2、CYSLTR2、LINC00302、RAB17、RIPK4、ARHGAP12、C2CD2、TRMT13、SOAT2和TTPAL）被选为候选生物标志物。在训练集和验证集中验证（P < 0.05）发现CYSLTR2在PD样本中显著下调，TTPAL显著上调，确定这两个基因为与MD功能障碍相关的生物标志物。基于这两个生物标志物表达谱构建的RF、GLM和SVM分类模型中，RF模型在训练集中AUC为1.000（95% CI: 1.000–1.000），SVM为0.997（95% CI: 0.991–1.000），GLM为0.990（95% CI: 0.975–1.000）。5折分层交叉验证显示RF的交叉验证AUC为0.839（95% CI: 0.786–0.891），GLM为0.818（95% CI: 0.713–0.923），SVM为0.925（95% CI: 0.887–0.962）。训练集中接近完美的表观AUC值伴随相对较低的交叉验证AUC值提示可能存在模型过拟合。在完全独立的外部队列GSE99039中分类性能大幅下降，提示这些模型在直接临床诊断应用方面存在局限性。
3.4 单个基因和联合列线图模型的诊断性能：CYSLTR2和TTPAL单独在训练集和验证集中的AUC范围为0.549至0.667，表明单个基因的判别性能有限。联合预测模型AUC达到0.707，校准曲线显示预测值与观测值高度一致，DCA证实模型具有更高的临床净获益和更优的整体预测性能。
3.5 功能富集和免疫微环境分析：GSEA显示CYSLTR2显著富集于16条通路，包括核糖体、剪接体和神经活性配体-受体相互作用。TTPAL参与核糖体和致病性大肠杆菌感染通路，其中致病性大肠杆菌感染通路下调，核糖体通路趋于上调。xCell算法计算64种免疫细胞类型的浸润评分，揭示6种差异免疫细胞类型（P < 0.05）：γδ T细胞、自然杀伤T（NKT）细胞、初始CD8+ T细胞、角质形成细胞、共同淋巴祖细胞和CD8+ T细胞。CD8+ T细胞与NKT细胞之间呈最强负相关（cor = ?0.334，P = 0.004），初始CD8+ T细胞与CD8+ T细胞之间呈最强正相关（cor = 0.562，P < 0.0001）。TTPAL与角质形成细胞之间呈最强正相关（cor = 0.300，P = 0.031）。
3.6 靶向生物标志物调控的可能性：CYSLTR2和TTPAL可能与9个TFs相互作用，两个基因均预测与E2F1和TP53相互作用。鉴定出22个靶向CYSLTR2的miRNAs和58个靶向TTPAL的miRNAs。整合的TF–miRNA–生物标志物调控网络包含98个节点和98条边。
3.7 两种生物标志物的化合物预测和分子对接：前20个预测小分子化合物构建了生物标志物-化合物相互作用网络（38个节点，40条边），4种化合物（苯丙胺、双酚A、纤维素和苯并[a]芘）与CYSLTR2和TTPAL均存在相互作用。分子对接显示苯丙胺与CYSLTR2的预测结合能为?6.6 kcal/mol，而内源性配体LTC4、LTD4和LTE4分别为?8.9、?7.7和?7.8 kcal/mol，表明苯丙胺的结合力弱于内源性配体。苯丙胺可进入CYSLTR2的预测结合口袋并与SER169残基相互作用，距离为2.6 ?。
3.8 CYSLTR2和TTPAL的亚细胞定位和GGI网络：CYSLTR2主要定位于质膜，TTPAL主要分布于细胞质。GGI网络分析预测CYSLTR2和TTPAL分别有10个和11个功能相似的靶基因。预测的功能通路包括多巴胺受体信号通路、磷脂酰肌醇-磷酸结合、磷脂酰肌醇结合和GTPase复合物。
3.9 临床样本中两种生物标志物的进一步验证：RT-qPCR结果显示CYSLTR2在PD组中表达降低，TTPAL表达升高（均P < 0.0001），与GSE6613和GSE99039数据集中的表达模式一致。鉴于样本量较小，这些发现应谨慎解读。
讨论部分总结：本研究通过整合GEO转录组数据集与MDRGs，鉴定出两个新型生物标志物（CYSLTR2和TTPAL），阐明了其相关通路，为PD病理机制提供了新见解。CYSLTR2编码一种G蛋白偶联受体，介导细胞对半胱氨酰白三烯的反应，并作为内源性神经酰胺受体，在调节人类免疫反应和炎症级联中发挥关键作用。本研究中CYSLTR2在生物信息学数据集和临床PD样本中均显著下调，提示其在不同神经退行性疾病中可能具有异质性作用。GSEA揭示CYSLTR2显著富集于神经活性配体-受体相互作用通路，其下调可能破坏神经活性配体-受体串扰，潜在促进PD的发生和进展。TTPAL编码生育酚转移蛋白家族成员，α-生育酚作为强抗氧化剂保护细胞免受氧化应激损伤。GSEA显示TTPAL显著富集于致病性大肠杆菌感染通路，PD患者常表现出肠道菌群失调，致病性大肠杆菌菌株相对丰度增加，可能通过肠-脑轴触发系统性炎症反应。研究人员推测TTPAL过表达可能通过改变神经元脂质代谢破坏神经元稳态，干扰神经递质合成、储存和释放。GGI网络显示CYSLTR2和TTPAL与GNAQ亚家族成员（GNA14、GNA15和GNA11）相互作用，GNAQ亚家族激活的信号通路可调节细胞内钙水平和蛋白激酶C（PKC）活性，进而影响多巴胺转运体或受体功能。免疫浸润分析揭示PD和对照组之间存在6种差异免疫细胞类型，表明PD中免疫微环境发生深刻改变。E2F1和TP53被预测共同调控两个生物标志物的表达，E2F1作为细胞周期关键调控因子，在维持基因组稳定性方面发挥重要作用。化合物筛选分析中，36种预测化合物中20种具有毒性，2种功能意义不明确，2种为人体内源性正常生理生化化合物，其余12种无毒性或毒性可耐受且具有成熟临床应用。其中纤维素可有效靶向两个生物标志物。苯丙胺可触发腹侧纹状体和内侧眶额皮质内源性多巴胺释放，但具有滥用潜力和高剂量神经毒性，限制了其治疗适用性。
结论部分翻译：通过整合GEO转录组数据与MDRGs，本研究鉴定出两个与PD中MD功能障碍相关的新型生物标志物（CYSLTR2和TTPAL）。研究人员系统表征了这些生物标志物，从而加深了对MD功能障碍背景下PD病理学的理解。这些发现为剖析PD病理生理学和推进假设驱动的实验研究提供了具有生物学意义的靶点。然而，本研究存在若干局限性：第一，机器学习模型在独立外部队列中表现有限，无法作为临床诊断工具使用；第二，用于RT-qPCR验证的临床样本量相对较小，样本量不足可能降低统计效能，观察到的CYSLTR2下调和TTPAL上调的表达趋势可能受到样本量有限导致的统计偏倚影响。
