《Glycoscience & Therapy》：Mass Spectrometry-Based Glycosylation Profiling in Autoimmune Diseases: Advances and Perspectives
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自身免疫性疾病（ADs）是一组免疫系统针对自身抗原产生异常应答、进而导致慢性炎症、组织损伤和器官功能障碍的异质性疾病。此类疾病带来的健康负担日益加重，已成为重要的公共卫生问题。尽管生物制剂、靶向免疫调节药物及综合治疗策略不断进步，部分患者仍存在治疗应答不足、疾
自身免疫性疾病（ADs）是一组免疫系统针对自身抗原产生异常应答、进而导致慢性炎症、组织损伤和器官功能障碍的异质性疾病。此类疾病带来的健康负担日益加重，已成为重要的公共卫生问题。尽管生物制剂、靶向免疫调节药物及综合治疗策略不断进步，部分患者仍存在治疗应答不足、疾病复发、长期疗效有限及不良反应等问题。因此，发现既能刻画疾病异质性又能预测治疗应答的分子标志物仍是研究重点。蛋白质糖基化作为一种关键翻译后修饰，可反映免疫调控中的分子变化，其分析在阐明疾病机制、界定疾病亚型及评估自身免疫性疾病疗效方面具有较大潜力。糖基化广泛参与生理功能与疾病进程。依据聚糖与载体分子间的连接类型及附着位点，糖基化主要可分为N-糖基化、O-糖基化及糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定，其中N-连接与O-连接糖基化是研究最广泛的两类形式。N-聚糖主要连接于共识序列基序（Asn-X-Ser/Thr，X≠Pro）内的天冬酰胺残基，而O-聚糖通常连接于丝氨酸或苏氨酸残基。早期血型抗原研究已表明，聚糖结构差异可决定免疫识别特性，为后续认识糖基化在免疫调节中的作用奠定了基础。随着研究深入，糖基化日益被视为免疫调控中的关键分子维度。参与固有免疫与适应性免疫应答的诸多关键蛋白均为糖基化蛋白。糖基化通过改变蛋白构象、稳定性及分子间相互作用，塑造免疫细胞的发育、活化、迁移与信号转导，从而调节免疫功能。在固有免疫中，糖基化直接参与病原体识别及免疫细胞向感染或炎症部位的迁移。例如，C型凝集素受体可识别微生物聚糖基序（如含甘露糖聚糖和β-葡聚糖）并触发免疫应答；选择素与其聚糖配体（如sialyl Lewis X）之间的相互作用构成白细胞滚动与募集的分子基础，该过程受糖基转移酶和磺基转移酶严格调控。此外，异常内源性聚糖（如α-甘露糖苷酶II缺陷所致杂合N-聚糖暴露）可被固有免疫系统识别，从而促进自身免疫应答。在适应性免疫中，糖基化精细调控淋巴细胞发育、活化与效应功能，同时显著影响抗体功能。例如，在T细胞中，MGAT5介导的β1,6-GlcNAc分支生成可与半乳糖凝集素相互作用形成抑制性分子晶格的N-聚糖，限制T细胞受体聚集并防止过度活化；在B细胞中，抑制性受体CD22识别由ST6Gal1生成的α2,6-唾液酸聚糖配体，负向调控B细胞受体信号，从而维持B细胞应答平衡。此外，抗体Fc区糖基化是调节其效应功能的关键因素：免疫球蛋白G（IgG）核心岩藻糖缺失可增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），而Fc唾液酸化增加在特定情境下与抗炎活性相关。综上，这些观察提示糖基化改变并非免疫应答的被动结果，而可能主动塑造免疫失调并参与疾病发病机制。然而，糖基化在宏观与微观层面均表现出显著异质性。宏观异质性指特定蛋白不同位点间聚糖占据率的差异，微观异质性指同一位点上所连接聚糖的结构多样性。因此，凝集素图谱等传统方法往往难以全面呈现糖基化变化所涉及的蛋白来源、修饰位点及聚糖精细结构。质谱（MS）在很大程度上克服了这一障碍，其不仅能确定聚糖组成，还可实现蛋白质糖基化的位点特异性定量分析。该能力对于区分蛋白丰度变化与糖基化占据率及糖型分布变化具有重要意义。借助质谱，糖组学与糖蛋白组学已成为研究免疫相关分子机制的重要方法，在自身免疫疾病的生物标志物发现、疾病分层及治疗应答评估方面显示出广阔潜力。为总结基于质谱的自身免疫疾病糖基化研究近期进展，研究人员在PubMed、Google Scholar、Scopus和Web of Science中进行了文献检索。针对每种疾病，将类风湿关节炎（RA）、IgA肾病（IgAN）、系统性红斑狼疮（SLE）和多发性硬化的疾病特异性术语，与至少一个糖基化相关术语（"glycosylation""glycan""glycopeptide""glycoprotein""glycomics"或"glycoproteomics"）及"mass spectrometry"以AND组合检索。超出本综述范围的研究（包括仅基于非人类样本、生物制药应用或不涉及质谱的分析方法）被人工排除。本文设计为叙述性而非系统性综述。鉴于2020年已发表关于自身免疫疾病异常糖基化的综述，研究人员主要聚焦2020年以来发表的研究，并总结基于质谱的糖基化分析在自身免疫疾病中的近期应用。
自身免疫性疾病（ADs）是一类免疫系统对自身抗原产生异常应答、导致慢性炎症、组织损伤和器官功能障碍的异质性疾病，其健康负担持续上升，已成为重要公共卫生问题。尽管生物制剂与靶向免疫调节药物不断进步，部分患者仍存在治疗应答不足、疾病复发、长期疗效有限及不良反应等问题，因此寻找既能刻画疾病异质性又能预测治疗应答的分子标志物仍是研究重点。蛋白质糖基化作为关键翻译后修饰，可反映免疫调控中的分子变化，在阐明疾病机制、界定疾病亚型及评估疗效方面具有较大潜力，但糖基化存在宏观异质性（同一蛋白不同位点聚糖占据率差异）与微观异质性（同一位点聚糖结构多样性），凝集素图谱等传统方法难以全面呈现蛋白来源、修饰位点与聚糖精细结构。质谱（MS）可确定聚糖组成并实现位点特异性定量分析，有助于区分蛋白丰度变化与糖基化占据率及糖型分布变化，据此研究人员对2020年以来基于质谱的糖基化研究进行叙述性综述，聚焦类风湿关节炎（RA）、IgA肾病（IgAN）、系统性红斑狼疮（SLE）和多发性硬化，总结疾病特异性糖基化特征及临床潜力，并讨论分析挑战与临床转化优先事项。该综述的重要意义在于系统整合了三个分析层次的质谱糖基化研究进展，为自身免疫疾病的机制解析、亚型划分、生物标志物发现与治疗监测提供了方法学与临床转化的参考框架。
在关键技术方法方面，研究人员主要采用三类质谱分析策略：聚糖水平分析（经酶法或化学法释放聚糖后检测，N-聚糖常用Peptide-N-Glycosidase F（PNGase F）释放，O-聚糖常用还原性β-消除释放）、糖肽水平分析（经胰蛋白酶或Lys-C酶解、必要时使用O-糖蛋白酶如OpeRATOR、IMPa、StcE，并结合亲水相互作用液相色谱（HILIC）、多孔石墨化碳（PGC）、肼化学、金属氧化物亲和色谱等富集）、完整糖蛋白或蛋白亚基水平分析（自顶向下、中下及天然质谱策略）；质谱采集包括基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）、液相色谱-电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）、阶梯碰撞能量高能碰撞解离（sceHCD）、电子转移解离（ETD）与EThcD、离子淌度质谱（IM-MS）及质谱成像（MSI）；数据分析使用Byonic、pGlyco系列、MSFragger-Glyco、StrucGP、Glyco-Decipher、GlycanFinder、O-Pair Search with MetaMorpheus等软件。纳入的临床样本队列来自已发表的RA、IgAN、SLE与多发性硬化患者及健康对照（HC）研究。
2 蛋白质糖基化的质谱表征。基于质谱的糖基化分析主要在三个层面开展：聚糖层面、糖肽层面及完整糖蛋白或蛋白亚基层面，三者分析深度、通量、结构分辨率与临床适用性各有优势且高度互补。研究人员通过梳理样本制备、质谱采集与生物信息学软件，指出聚糖层面分析通量高、适合大队列糖组重塑评估，但无法提供位点与载体蛋白信息；糖肽层面可同时给出糖基化位点与位点特异性聚糖组成或结构，是机制研究的重点，但糖肽丰度低、电离效率弱，需富集；完整糖蛋白与亚基层面可保留糖型组合与蛋白整体异质性信息，但对样本纯度、仪器分辨率与去卷积算法要求更高，目前多用于特定糖蛋白或抗体的靶向研究。在生物信息学方面，聚糖分析工具从GlycoMod、GlycoWorkbench发展到SimGlycan、MultiGlycan、GlycoHunter、GlycanFinder、GlycoGenius、GRITS Toolbox、GlycReSoft、GlycoQuest、Glycowork及基于深度学习的CandyCrunch；完整糖肽分析工具包括商业软件Byonic及开源pGlyco系列、MSFragger-Glyco、StrucGP、Glyco-Decipher、GlycanFinder，O-糖肽分析则借助O-Pair Search with MetaMorpheus等方法。研究人员据此说明数据处理工具的发展显著提高了复杂血浆、血清或免疫球蛋白样本中低丰度糖肽的鉴定覆盖度。
3 自身免疫性疾病。研究人员按疾病分类总结了近期基于质谱的研究，涵盖样本类型、样本量、分析物、靶蛋白、样本制备、质谱平台、数据分析与主要发现。
3.1 类风湿关节炎。RA以对称性多关节炎和进行性关节破坏为临床特征，核心机制为免疫失调，尤其是T、B细胞过度活化产生类风湿因子（RF）与抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）等自身抗体。自20世纪80年代Parekh等发现RA患者血清IgG Fc半乳糖化显著降低以来，研究随质谱进步转向位点特异性表征。Li等通过整合蛋白质组与糖蛋白组分析发现，RA进展中众多关键蛋白特定位点糖基化变化远超其总蛋白丰度变化，如α1-抗胰蛋白酶（AAT）在Asn70位点糖基化显著降低而Asn271位点显著升高，补体C4、因子B与因子H亦呈位点特异性改变，提示位点占据率评估可能比总蛋白丰度更具疾病相关性与诊断特异性。在免疫球蛋白层面，多项研究一致显示RA患者IgG Fc半乳糖化与唾液酸化降低并伴核心岩藻糖化改变；Sun等证明IgG半乳糖化在区分RA与健康对照中具较强诊断效能，平分型GlcNAc糖型在RA与骨关节炎间呈不同模式；Su等发现低半乳糖化、低唾液酸化与核心岩藻糖化升高与RF滴度正相关；Sénard等发现早期炎症性关节炎患者基线IgG2/3 Fc半乳糖化较高者更易在2年随访中达到临床缓解或维持低疾病活动度；?tambuk等观察到有效抗炎治疗后IgG半乳糖化与唾液酸化向正常水平回升，且以临床缓解者最为明显；Van Tol等报告RA患者IgA与免疫球蛋白M（IgM）亦存在半乳糖化降低，IgM平分型GlcNAc水平与RA强相关。作为RA标志性自身抗体，ACPA糖基化异常更为突出：多项纵向研究提示ACPA的Fab可变区N-糖基化频率异常升高，可在临床发病前检出并有助于风险分层；Stork等通过亚类特异性糖肽分析鉴定出Fab区携带多个N-聚糖的ACPA IgG1亚群，即多价Fab糖基化，并将糖基化异常与致病性B细胞克隆的演化选择相联系；Szabó等发现ACPA-IgG Fc低半乳糖化主要由IgG1与IgG3/4驱动而IgG2相对稳定，核心岩藻糖化在各亚类间变化方向相反；Gyebrovszki等提供直接证据表明ACPA IgG的低半乳糖/低唾液酸特征（尤其G0糖型Hex3HexNAc4）可经FcγRI更有效诱导单核细胞分泌TNF-α。此外，Xu等利用TMT定量蛋白质组与完整N-糖肽分析绘制RA滑膜组织图谱，鉴定出1,260条完整N-糖肽、481个糖基化位点、334种糖蛋白，与骨关节炎滑膜相比有76条完整N-糖肽显著改变（67条上调、9条下调），并发现60条RA特异性N-糖肽，部分糖肽水平与特定免疫细胞亚群富集评分显著相关，且异常N-糖基化与FUT8等多种糖基化相关酶表达升高有关。上述结果提示RA以免疫相关蛋白与自身抗体的糖基化重塑为特征，涉及特定位点、亚类与抗原特异性层面，可能调节免疫效应功能、疾病异质性与临床结局。
3.2 IgA肾病。IgAN被视为全球最常见的原发性肾小球肾炎，病理标志为以IgA1为主的免疫复合物在系膜区沉积，IgA1铰链区（HR）O-糖基化异常与IgAN相关，患者IgA1 HR的O-聚糖半乳糖化显著低于健康人，导致半乳糖缺陷型IgA1（Gd-IgA1）生成增加。研究人员通过汇总质谱研究说明，IgAN患者IgA1 O-糖肽的GalNAc、半乳糖（Gal）含量及Gal/GalNAc比值显著低于IgA沉积（IgAD）、过敏性紫癜性肾炎（HSPN）及健康对照；IgA N-糖基化与IgA1 O-聚糖唾液酸化与IgAN状态及估算肾小球滤过率（eGFR）相关，且基于质谱的糖肽指标在预测IgAN与肾功能下降方面优于基于凝集素的Gd-IgA1检测；血浆多聚IgA1（pIgA1）在IgAN中显著低糖基化，GalNAc数目与新月体比例呈负相关，提示其可作为重症表型标志物；一锅法样本制备结合液相色谱-三重四极杆质谱（LC-QQQ-MS）显示IgAN唾液酸化降低并与eGFR相关；不同种族间存在异质性，高加索人群Gd-IgA1升高与HR每位点Gal减少较亚洲人群更明显；比较IgAN与疾病对照（DC）及健康对照，IgAN患者GalNAc与半乳糖数目显著减少，单项指标优于KM55 ELISA，GalNAc、半乳糖与总IgA联合具非侵入性生物标志物潜力；GlycoQuant流程鉴定出182条完整N-糖肽，其中IgAN丢失11条、膜性肾病（MN）丢失10条，可区分慢性肾脏病与健康队列；扁桃体切除联合糖皮质激素治疗（T-CST）可选择性降低致病性T抗原（Gal1GalNAc1）及Asn340位点核心岩藻糖化N-聚糖，而单纯激素治疗（CST）、保守治疗（CO）与观察组无变化。
3.3 系统性红斑狼疮。研究人员总结SLE相关质谱研究：Alves等采用基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）对狼疮性肾炎（LN）与健康对照的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肾活检组织进行空间糖组学分析，发现LN具有独特肾脏糖特征，表现为高甘露糖/杂合N-聚糖与O-甘露糖化增加、复杂N-聚糖减少，诊断性组织甘露糖化可预测慢性肾脏病进展；对101例抗双链DNA（anti-dsDNA）阳性SLE患者的研究显示，抗dsDNA IgG1岩藻糖化、半乳糖化与唾液酸化随SLE疾病活动指数（SLEDAI）升高，抗dsDNA IgG1糖型在反映狼疮活动方面优于总IgG1，其中岩藻糖化最为突出；在包括SLE的碰撞诱导解离（CID）队列中，治疗使低半乳糖化、低唾液酸化的促炎IgG糖特征转为G0F降低、G2F与G2FS升高的抗炎特征，缓解与IgG2/3二半乳糖化加速及IgG4无半乳糖化更大程度下降相关；活动性LN与非肾性SLE可经IgG三天线聚糖（末端唾液酸化与次末端半乳糖化）区分，且该特征随治疗逆转，LN-IgG可经代谢重编程破坏足细胞糖酵解，活动性LN尿丙酮酸升高；MAN2B2双等位基因功能缺失变异可致伴LN的SLE，其N-糖基化紊乱表现为Man5/Man9与Man5/Man6比值升高，扰乱未折叠蛋白反应（UPR）并触发I型干扰素/NF-κB过度活化。
3.4 多发性硬化。研究人员汇总多发性硬化质谱研究：与健康对照相比，多发性硬化患者IgG核心岩藻糖化降低、高甘露糖聚糖升高，同时总血浆复杂聚糖升高、低分支结构减少；血清分析显示多发性硬化IgM唾液酸化升高、IgG1/IgG2聚糖增加，CO8B与ApoD糖基化改变，且CO8B与ApoD聚糖可高准确度区分多发性硬化与视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）；女性患者唾液酸化、半乳糖化与高甘露糖聚糖升高而男性无显著变化；血浆N-糖组分析可区分多发性硬化与抗体定义疾病、MOG抗体相关疾病（MOGAD）与AQP4抗体阳性NMOSD、复发缓解型（RRMS）与继发进展型（SPMS），抗体定义疾病表现为单唾液酸化、三半乳糖化、分支及天线岩藻糖化增加，而多发性硬化表现为三唾液酸化升高与分支减少，且不依赖抗体状态。
最后为讨论与结论部分。研究人员在综述中讨论了基于质谱的糖基化分析在自身免疫疾病中的分析挑战与临床转化优先事项，指出三个分析层面各具优势且互补，样本制备、质谱采集与数据处理工具的进步提升了低丰度糖肽的鉴定覆盖度，疾病特异性糖基化特征在生物标志物发现、疾病分层与治疗应答监测方面显示出临床潜力，而标准化谱库建设与人工智能算法发展有望进一步提高自动化与分析深度。研究结论为：基于质谱的糖基化分析能够在聚糖、糖肽及完整糖蛋白/亚基三个层面刻画自身免疫疾病的糖基化改变，RA、IgAN、SLE与多发性硬化均呈现疾病特异性糖基化特征，这些特征具有作为生物标志物、疾病分层与治疗监测指标的临床潜力，但实现临床转化仍需解决分析方法学与标准化方面的挑战。
