Resorcimoline对H?O?诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的保护作用研究

《IBRO Neuroscience Reports》：Resorcimoline Protects Human Neuroblastoma Cells (SH-SY5Y) against H?O?-Induced Oxidative Stress

　　

背景：氧化应激是神经元功能障碍和细胞死亡的主要诱因，并深度参与卒中及慢性神经退行性疾病的发病与进展。既往研究已证实抗氧化剂的神经保护作用，然而其体内稳定性和血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）通透性方面的局限性可能限制其治疗效果。相比之下，RML的体内稳定性和BBB通透性尚未确定。因此，开发新型自由基清除剂具有必要性。本研究的对象Resorcimoline（RML）此前已表现出对多种自由基物种的高清除活性，并在后肢缺血-再灌注模型中显示出器官保护作用。本研究采用过氧化氢（H?O?）诱导氧化应激的神经元细胞模型，评估RML的保护作用。

方法：研究人员使用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞进行实验。细胞活力通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）法测定。H?O?诱导的细胞损伤通过检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放进行评估。H?O?诱导的活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成使用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）、CellROX Green、MitoSOX Red和二氢乙啶（dihydroethidium, DHE）进行检测。Caspase-3活性以N-Ac-DEVD-AFC为特异性底物进行测定。

结果：在SH-SY5Y细胞中，H?O?暴露降低了细胞活力，并增加了LDH释放、ROS相关荧光及caspase-3活性。RML显著减轻了H?O?诱导的细胞活力下降，在10 μM和100 μM浓度下分别将细胞活力从H?O?组的63.94 ± 4.83%提升至70.28 ± 2.98%和72.21 ± 1.92%。10 μM和100 μM的RML分别显著降低H?O?诱导的LDH释放23.0%和28.3%。与H?O?组相比，DCFDA荧光在10 μM和100 μM浓度下分别降低48.2%和55.6%。此外，100 μM的RML使H?O?诱导的caspase-3活性显著降低14.8%。

结论：RML减轻了SH-SY5Y细胞中H?O?诱导的氧化应激相关改变和细胞损伤，提示RML作为保护神经元细胞免受氧化应激相关损伤的潜在候选药物值得进一步研究。

论文解读：Resorcimoline对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的保护作用

氧化应激是神经元功能障碍和细胞死亡的重要诱因，深度参与卒中、创伤性脑损伤等急性神经系统疾病以及阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等慢性神经退行性疾病的发病与进展（Liu et al., 2017; Kim et al., 2015; Bej et al., 2024; Dash et al., 2025）。超氧阴离子（O?•?）和羟基自由基等自由基可诱发脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤，进而导致神经元损伤（Kim et al., 2015; Biswas et al., 2017）。当活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生超过谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等抗氧化防御系统的清除能力时，即发生氧化应激（Ceci et al., 2022; Eddaikra and Eddaikra, 2021; Chirino et al., 2010）。既往研究已证实维生素C和维生素E等抗氧化剂的神经保护作用，但它们在体内稳定性和血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）通透性方面的局限性可能限制其治疗有效性（Teleanu et al., 2019; Muripiti et al., 2019; Campos-Esparza et al., 2009; Mika and Antończyk, 2023; Daraban et al., 2024）。此外，过量摄入抗氧化剂可能反而加剧氧化应激，凸显了审慎评估抗氧化策略的必要性（Sotler et al., 2019; Lawenda et al., 2008）。近年来，开发性能更优的新型自由基清除剂受到广泛关注（Haider et al., 2020; Lu et al., 2024）。

Resorcimoline（RML）是本研究关注的化合物，是在多酚类化合物合成过程中偶然发现的新型化合物，已证实对多种自由基物种具有清除活性（Tokumaru et al., 2025）。据报道，RML与O?•?的反应速率常数约为临床使用的自由基清除剂依达拉奉的三倍（Tokumaru et al., 2025）。RML在室温（约23℃）、非避光条件及重水中均表现出高稳定性（Tokumaru et al., 2025）。然而，RML对氧化应激条件下神经元细胞的作用尚未见报道，其体内稳定性和BBB通透性也未确定。研究人员假设RML能够减轻过氧化氢（H?O?）诱导的神经元细胞氧化应激和细胞损伤，并据此在H?O?诱导氧化应激的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模型中评估RML的保护作用及其对ROS生成、细胞损伤和caspase-3活性的影响。

为实现上述研究目标，研究人员采用多种实验方法。细胞活力使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法测定；细胞膜损伤通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放进行评估；H?O?诱导的ROS生成分别使用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）、CellROX Green、MitoSOX Red和二氢乙啶（dihydroethidium, DHE）四种荧光探针进行检测，其中MitoSOX Red和DHE分别用于评估线粒体和细胞质O?•?相关荧光；caspase-3活性以N-Ac-DEVD-AFC为特异性底物进行测定。此外还通过明场显微镜观察细胞形态学变化。样本来源方面，人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞由大分大学神经病学系提供，并通过短串联重复基因分型确认与SH-SY5Y（CVCL_0019）匹配。RML由TechnoPro R&D公司（东京，日本）生产，纯度为97.4%。所有数据以均值±标准差（SD）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Dunnett多重比较检验，以H?O?单独处理组为参照组，p < 0.05为差异有统计学意义。

研究结果部分如下：

CCK-8法检测细胞活力：SH-SY5Y细胞暴露于150 μM H?O? 4小时后，细胞活力降至未处理对照组的63.94 ± 4.83%。RML在10 μM和100 μM浓度下将细胞活力分别提升至70.28 ± 2.98%和72.21 ± 1.92%，相对H?O?组分别增加9.92%和12.93%，差异具有统计学意义（p = 0.01和p = 0.001）；而0.1 μM和1 μM浓度的差异无统计学意义。该结果表明RML能够减轻H?O?诱导的代谢活性降低。

LDH释放检测：细胞暴露于500 μM H?O? 4小时后，LDH释放为76.23 ± 6.58%。RML在10 μM和100 μM浓度下将LDH释放分别降至58.71 ± 2.30%和54.64 ± 8.66%，相对H?O?组分别降低22.98%和28.32%，差异具有统计学意义（p = 0.0003和p < 0.0001）。该结果表明RML能够减轻H?O?诱导的细胞膜损伤。

明场显微镜观察：对照SH-SY5Y细胞呈长形形态并具有神经突样突起，100 μM RML单独处理未引起明显形态变化。H?O?暴露导致细胞密度降低、细胞肿胀和变圆。RML共处理与H?O?单独处理相比，细胞形态得到一定程度的保存，其中100 μM RML组显示出比低浓度组更好的细胞密度和形态保留。该形态学观察结果与CCK-8和LDH定量结果一致，但由于未进行定量形态学分析，仅作为支持性证据。

DCFDA荧光检测：H?O?暴露显著增加DCFDA荧光（p < 0.0001）。与H?O?组相比，RML在1、10、100 μM浓度下分别将荧光降低25.29%、48.24%和55.60%（原文数值，摘要中为45.56%、48.24%、55.60%，此处以结果部分为准，1 μM为45.56%，0.1 μM为25.29%），其中1、10、100 μM浓度的降低具有统计学意义（p = 0.003、p = 0.002、p = 0.0004）。该结果表明RML可减轻H?O?诱导的细胞内总ROS相关荧光增强。

CellROX Green荧光检测：H?O?暴露显著增加CellROX Green单位细胞荧光面积（p < 0.0001）。与H?O?组相比，RML在1、10、100 μM浓度下分别将单位细胞荧光面积降低30.96%、56.16%和58.18%，其中10 μM和100 μM浓度的降低具有统计学意义（p = 0.008和p = 0.006）。该结果进一步支持RML对H?O?诱导氧化应激的减轻作用。

MitoSOX Red荧光检测：H?O?暴露显著增加MitoSOX Red单位细胞荧光面积（p < 0.0001）。RML在100 μM浓度下将单位细胞荧光面积降低51.93%（p = 0.0004），而10 μM（25.56%，p = 0.06）和1 μM（5.29%，p = 0.95）的降低未达到统计学显著。该结果表明RML在高浓度下可减轻H?O?诱导的线粒体O?•?相关氧化应激。

DHE荧光检测：H?O?暴露显著增加DHE单位细胞荧光面积（p < 0.0001）。与H?O?组相比，RML在1、10、100 μM浓度下分别将单位细胞荧光面积降低11.32%、31.95%和49.27%，其中10 μM和100 μM浓度的降低具有统计学意义（p = 0.04和p = 0.002）。该结果表明RML可减轻H?O?诱导的细胞质O?•?相关氧化应激。

Caspase-3活性检测：细胞暴露于50 μM H?O? 4小时后，caspase-3活性较未处理对照组显著升高（p < 0.0001）。RML在100 μM浓度下使caspase-3活性相对H?O?组降低14.78%（p = 0.03），而较低浓度的降低未达到统计学显著。该结果表明RML可在一定程度上减轻H?O?诱导的凋亡信号激活。

讨论部分指出，本研究在不同实验中使用了不同的H?O?浓度，这是为建立适合各实验终点的可重复损伤条件而有意设计的，并非为了确定半数效应浓度（EC??）或直接比较不同实验间的氧化应激程度。CCK-8法主要反映细胞代谢活性，LDH释放反映质膜损伤，二者评估的是细胞损伤的不同方面。ROS成像实验采用300 μM H?O?，caspase-3实验采用50 μM H?O?，均基于预实验确定的可测量条件。在RML给药时机方面，ROS成像实验中RML在H?O?暴露30分钟后加入并持续至60分钟暴露结束；caspase-3实验中RML在H?O?暴露4小时后加入并孵育30分钟。因此，RML是在氧化应激已启动后给予而非预处理。RML此前被报道不直接与H?O?反应（Tokumaru et al., 2025），因此该实验设计旨在评估RML在持续氧化挑战期间的作用。研究人员强调，四种荧光探针的结果不能直接证明RML在细胞内化学清除特定ROS物种，而是表明RML处理与H?O?诱导的ROS相关荧光降低相关联。结合RML对多种自由基物种的清除活性（Tokumaru et al., 2025），现有细胞数据支持RML的抗氧化特性可能有助于减轻细胞内氧化应激，但直接测量细胞内自由基反应和机制研究仍属必要。与维生素C和E相比，RML具有不同的化学特性，且其对O?•?的反应速率常数约为依达拉奉的三倍，并在多种条件下表现出高稳定性，但物化特性不能直接等同于生物学功效。caspase-3活性的降低可能反映RML对凋亡信号的影响，也可能是氧化应激减轻的继发效应，尚无法确定直接机制。研究局限性包括：仅使用单一SH-SY5Y细胞系、未确定细胞分化状态、未设置阳性抗氧化对照、未直接测量细胞内特定ROS的化学清除、分子机制尚不完全清楚，以及未进行体内药代动力学、生物利用度、BBB通透性和安全性评估。未来研究应在脑缺血-再灌注及相关神经系统疾病动物模型中评估RML的效应，并进行与既有抗氧化剂的比较研究和机制探讨。

研究结论为：在本实验条件下，RML减轻了SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中H?O?相关的细胞损伤、ROS相关荧光和caspase-3活性。这些发现表明RML在体外具有抗氧化应激的细胞保护作用。然而，本研究并未建立对特定ROS物种的直接细胞内清除证据，也未证明体内治疗效果。需要进一步研究确定RML在神经系统疾病动物模型中的药代动力学、BBB通透性、安全性和疗效。