《Immunobiology》：An increase in serum levels of intranuclear proteins is associated with the development of transplant-associated thrombotic microangiopathy
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背景：异基因造血干细胞移植（HSCT）是难治性血液病的治愈性治疗手段，但其成功常受限于危及生命的内皮损伤相关并发症，如肝窦阻塞综合征（SOS）和移植相关血栓性微血管病（TA-TMA）。由于早期干预对改善预后至关重要，亟需识别特异性预测生物标志物。受损细胞释放的
背景：异基因造血干细胞移植（HSCT）是难治性血液病的治愈性治疗手段，但其成功常受限于危及生命的内皮损伤相关并发症，如肝窦阻塞综合征（SOS）和移植相关血栓性微血管病（TA-TMA）。由于早期干预对改善预后至关重要，亟需识别特异性预测生物标志物。受损细胞释放的核蛋白，如高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和组蛋白H3（H3），被认为是参与内皮损伤的损伤相关分子模式（DAMPs），可能作为潜在生物标志物。研究设计：研究人员开展了一项前瞻性研究，从115例接受异基因HSCT的患者中自预处理前至移植后第28天连续采集血液样本。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清HMGB1和H3水平，并通过受试者工作特征（ROC）曲线分析和逻辑回归探讨其与SOS及TA-TMA发生的关联。结果：观察期间，10例患者（8.7%）发生SOS，13例（11.3%）发生TA-TMA。值得注意的是，血清HMGB1从基线至第14天或第28天的升高，以及第21天H3水平升高，与随后TA-TMA的发生显著相关。此外，第14天HMGB1水平可预测SOS的发生。多因素分析证实，第14天高HMGB1水平是TA-TMA的独立预测因子。结论：HMGB1有望作为TA-TMA的预测标志物。然而，由于本研究为探索性、单中心、小样本研究，需在更大队列中进一步验证。
异基因造血干细胞移植（HSCT）是多种血液系统恶性肿瘤及难治性造血疾病的唯一治愈手段。随着支持治疗的进步，其适应证不断扩大，治疗结局有所改善。然而，移植后并发症仍是主要问题，尤其是与内皮损伤相关的危及生命综合征，如肝窦阻塞综合征（SOS）和移植相关血栓性微血管病（TA-TMA）。SOS通常在HSCT后21天内发生，临床特征包括体重增加、液体潴留伴腹水、肝区压痛性肝大及黄疸。TA-TMA通常出现较晚，中位发病时间为移植后35天（范围3–482天），临床表现包括微血管病性溶血性贫血、输血难治性血小板减少及器官功能障碍。研究报道SOS发生于约2–15%的异基因移植受者中，尽管支持治疗和靶向治疗的进展使完全缓解率提高至65%以上，但当SOS进展为伴多器官功能障碍的重症时，死亡率仍然很高。大规模荟萃分析显示TA-TMA影响约12%的患者，且预后极差。尽管去纤苷（DF）使SOS成为可治疗疾病，但早期干预可显著提高疗效，凸显早期诊断的重要性。相比之下，TA-TMA尚无确定的标准化疗方案，但补体C5抑制剂依库珠单抗、去纤苷及重组人可溶性血栓调节蛋白等靶向治疗已显示临床疗效。SOS和TA-TMA以血管内皮细胞损伤为核心病理机制。预处理所用的照射和化疗药物、钙调神经磷酸酶抑制剂及同种反应性等因素均可导致内皮细胞损伤。SOS的发生与肝窦内皮细胞损伤密切相关，损伤破坏相邻细胞间的黏附，形成间隙使细胞成分进入Disse间隙，导致肝窦狭窄和阻塞，进而减少肝窦静脉流出。TA-TMA被归类为继发性TMA，多种因素引起血管内皮细胞损伤，导致促血栓状态。“二次打击学说”认为预先存在的危险因素（第一次打击）如多次移植或预处理方案，随后由第二个促凝触发因素（第二次打击）如某些药物、移植物抗宿主病（GVHD）或感染所驱动。这些并发症通常基于既定的临床标准进行诊断，但SOS的诊断标准如高胆红素血症和腹水在HSCT后常见且不具特异性；TA-TMA的诊断标准包括肾功能不全、贫血、血小板减少及外周血裂红细胞，同样不具特异性。主要由非特异性临床项目组成的诊断标准固有地增加了假阳性分类的风险。HMGB1是一种高度保守的非组蛋白核蛋白，在生理条件下调控染色质结构和基因转录。当从坏死或活化的免疫细胞释放至细胞外时，HMGB1作为原型损伤相关分子模式（DAMP），通过Toll样受体4（TLR4）和晚期糖基化终产物受体（RAGE）等受体放大炎症反应。除促炎作用外，HMGB1还可激活血小板并上调组织因子表达，从而在炎症与凝血之间提供机制联系。组蛋白是维持核小体稳定性和基因调控所必需的核心核蛋白。其中，细胞死亡或中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成过程中释放的细胞外组蛋白H3（H3）对内皮细胞发挥直接细胞毒性作用。此外，H3促进血小板聚集、激活凝血级联并诱导微血管血栓形成。这些特性使H3成为炎症、内皮损伤和凝血交汇处的重要介质。HMGB1和组蛋白（包括H3）等核蛋白在内皮细胞应激或凋亡过程中释放，这些过程是内皮病（包括TA-TMA和SOS）病理生理学的核心。它们在循环中的存在反映了内皮损伤的严重程度，并有助于放大补体激活、血小板聚集和微血管闭塞。除从受损组织被动释放外，HMGB1由活化的单核细胞主动分泌，HMGB1和组蛋白均通过NETosis过程中中性粒细胞被挤出至细胞外空间。因此，测定循环HMGB1和H3为在临床表现之前预测早期内皮损伤提供了强有力的生物学依据。鉴于这些生物学活性，HMGB1和H3不仅被视为细胞和组织损伤的标志物，还被视为血栓炎症过程的 active 介质。因此，监测其循环水平可能为HSCT后SOS和TA-TMA等内皮并发症的早期检测提供有价值的见解。本研究旨在探讨包括HMGB1和H3在内的核内蛋白血清浓度变化与接受HSCT患者SOS和/或TA-TMA发生之间的关联，并评估其作为早期预测生物标志物的潜在效用。
研究人员开展了前瞻性研究，纳入2017年至2024年间在福岛医科大学医院血液科接受异基因HSCT的148例患者，最终115例患者纳入分析，共676份样本。于预处理前、移植当天及移植后第7、14、21、28天连续采集血样。采用Shino-Test公司（日本神奈川）开发的酶联免疫吸附试验（ELISA）测定H3和HMGB1血清浓度。SOS依据欧洲血液和骨髓移植学会（EBMT）标准诊断。TA-TMA采用国际协调标准诊断，但因日本常规无法测定可溶性C5b-9，故基于排除C5b-9的协调标准进行诊断，满足至少4项标准即诊断为TA-TMA。采用EZR软件进行统计分析。鉴于血清HMGB1和H3水平的显著个体间变异和右偏分布，主要采用非参数检验（Mann-Whitney U检验）进行组间比较。为评估生物标志物对并发症发生的预测能力，每个移植后时间点制备两个变量：绝对血清浓度和相对于预处理基线的比值。进行ROC曲线分析，采用约登指数确定最佳截断值。基于截断值将患者分为高标志物组和低标志物组，采用Fisher精确检验评估高标志物组并发症发生率是否显著高于低标志物组。采用Kaplan-Meier法生成无SOS生存曲线和无TMA生存曲线，并以log-rank检验进行比较。AUC>0.7被认为具有临床可接受的判别能力。进行单因素分析评估既往报道的SOS和TA-TMA危险因素以及ROC衍生的截断值是否与这些并发症的发生相关。随后进行多因素逻辑回归分析以确定TA-TMA的独立危险因素，变量选择采用后向逐步消除法。所有统计分析使用EZR on R Commander（版本1.68）进行，双侧p值<0.05被认为具有统计学意义。
结果方面，患者中位年龄55岁（范围18–68岁），包括57例男性和58例女性。最常见的基础疾病为急性髓系白血病（42例）。并发症方面，13例发生TA-TMA，中位发病时间为第61天（范围8–115天）；10例发生SOS，中位发病时间为第27天（范围8–43天）。SOS严重程度按EBMT标准分级为轻度4例、中度0例、重度3例和极重度3例。TA-TMA按协调标准分为标准风险4例和高风险9例。aGVHD发生于56例患者，中位发病时间为40天（范围10–100天），其中17例（14.8%）发生III/IV级aGVHD。Kaplan-Meier生存曲线显示，发生TA-TMA或SOS的患者总生存率显著低于无这些并发症的对照组患者。中位观察期为330天（范围4–2553天）。在时间进程变化方面，除第0天外，随后发生TA-TMA的患者在整个观察期内HMGB1水平呈高于对照组的趋势。H3水平在随后发生TA-TMA的患者中差异更为明显。而SOS患者与对照组相比，两种标志物均未显著升高。在HMGB1和H3血清水平升高与SOS和TA-TMA发生的关联方面，对照组与SOS组之间，第14天血清HMGB1水平达到临床可接受的判别能力（AUC>0.7）。对照组与TA-TMA组比较，HMGB1相对比值在第7天和第14天显示出显著预测价值，比值通常表现出略强的性能。第14天HMGB1比值（第14天/预处理前）预测TA-TMA的AUC为0.797，最佳截断值为0.575时灵敏度和特异度分别为80.0%和78.1%（p<0.001）。第7天比值亦为显著预测因子，AUC为0.723。第28天H3比值（第28天/预处理前）也显示预测价值，AUC为0.738。此外，第21天H3血清水平达到显著预测价值（AUC=0.722）。Kaplan-Meier分析显示，除第7天/预处理前外，高HMGB1组在所有时间点的无TMA生存率均显著低于低HMGB1组。第21天较高H3水平显示类似结果。第14天高HMGB1组的无SOS生存率显著较低。在患者特征方面，发生SOS的患者中7例合并aGVHD，其中3例为III/IV级。发生TA-TMA的患者中9例合并aGVHD，其中7例为III/IV级，比例显著较高。单因素分析显示，III/IV级aGVHD的发生与TA-TMA的发生显著相关，但与SOS无关。此外，既往HSCT和预处理条件也与TA-TMA的发生相关。关于SOS，既往HSCT和疾病风险与SOS的发生相关。在五个显著生物标志物截断值中，第14天/预处理前HMGB1指标与TA-TMA的发生显著相关。第21天H3血清水平也与TA-TMA的发生显著相关。关于SOS，第14天HMGB1血清水平与SOS显著相关。多因素分析采用后向逐步消除法构建的最终模型显示，第7天/预处理前和第14天/预处理前HMGB1是TA-TMA发生的显著独立预测因子，即使调整其他临床变量后亦然。此外，III/IV级aGVHD的存在和高风险疾病状态也被确定为最终模型中的独立危险因素。在HMGB1与白细胞计数的相关性方面，从预处理前至第28天的白细胞计数和血清HMGB1浓度的纵向趋势显示，两者呈现相似模式：预处理后水平下降，第7天达到最低点，随后恢复。Spearman秩相关分析显示两者之间存在中等程度的显著正相关（R=0.62，p<0.001）。然而，与HMGB1不同，H3水平与白细胞计数之间未观察到显著相关性。
讨论部分，研究人员证明了移植后第7天和第14天血清HMGB1水平较预处理基线升高与TA-TMA发生率较高显著相关。然而，H3水平从预处理前至移植后的绝对变化或相对升高均未显示对TA-TMA发生的预测价值。H3水平极低，在大多数样本中无法检测到，因此计算绝对变化或相对于基线的比值可能不是检测有意义差异的适当方法，因为此类计算受接近零的初始值影响很大。HMGB1是已知的内皮损伤和炎症反应放大因子，促进凝血激活和微血管损伤。最初研究人员假设移植后血清HMGB1升高主要反映预处理方案引起的组织损伤，但与本预期相反，研究人员发现白细胞计数与血清HMGB1水平呈正相关。这一发现强烈支持活化的白细胞在粒细胞植入后主动将核HMGB1释放至细胞外空间的假设。GVHD和感染均为TA-TMA的公认危险因素。在这些条件下，白细胞被细胞因子激活、释放HMGB1，从而诱导内皮损伤最终导致TA-TMA的发生，这是合理的。另一个可能激活白细胞的候选因素是补体因子。既往研究显示TA-TMA的发生与补体通路激活之间存在密切联系。HMGB1已被广泛研究并确立为众多炎症性疾病和感染中的关键介质。在HSCT背景下，Yujiri等证明HMGB1可作为急性GVHD的有用预测标志物，Nomura等报道了HMGB1浓度与血小板计数之间的关系。然而，这些既往研究未直接探讨HMGB1水平与TA-TMA发生之间的关联。此外，此前无报道描述HMGB1浓度与白细胞计数之间的相关性，凸显了本研究的新颖性。连续追踪HMGB1水平并将其动力学与临床结局联系起来的研究有限，突出了研究人员发现的重要意义。观察到的HMGB1与白细胞之间的相关性未必反映TA-TMA特异性过程，而可能指示更广泛的全身炎症反应。HMGB1在炎症和内皮损伤背景下已知升高，其升高也可能受补体激活（包括C5b-9）或增强的NETosis影响——两者均与TA-TMA的发病机制有关。因此，需要进一步的机制研究以确定这些通路中哪一个主要贡献于研究人员队列中观察到的HMGB1升高。aGVHD与TA-TMA之间的关联已有充分文献记载，aGVHD在研究人员队列中也很常见（n=56）。为剖析GVHD的混杂效应，研究人员通过排除严重（III/IV级）aGVHD发病后采集的所有血清样本进行了敏感性分析，与感染的处理方式相同。在评估该标准下的TA-TMA队列时，无样本落入III/IV级aGVHD后类别，因此零份TA-TMA相关样本被排除。研究人员还进行了无SOS和无TMA生存的Kaplan-Meier分析，该再分析结果与主要发现几乎相同，提示HMGB1与TA-TMA的关联独立于活动性aGVHD。在多因素分析中，尽管疾病风险在单因素分析中无统计学意义，但在多因素模型中成为TA-TMA的独立预测因子。这种揭示效应提示基础疾病风险的预后影响可能在单因素环境中被混杂的基线变异（如预处理强度）所掩盖，但一旦对这些协变量进行数学调整后便显现出来。虽然许多既往探索SOS/TA-TMA预测标志物的研究聚焦于其他与内皮损伤相关的分子，如ST2、血管生成素-2和血管性血友病因子，这些标志物在SOS和TA-TMA中均升高，但无法区分这些内皮细胞损伤相关并发症。重要的是，本研究发现核内蛋白血清水平升高仅预测TA-TMA而非SOS。需要进一步研究探索活化炎症细胞分泌的DAMPs在TA-TMA发病机制中的作用。关于核内蛋白的预测效用，区分绝对浓度和相对倍数升高很重要。在单因素分析中，第14天HMGB1绝对水平与SOS显著相关，可能反映伴随移植后早期并发症的一般性全身组织损伤和炎症。然而，在多因素分析中，HMGB1绝对水平对SOS失去独立预测意义。相比之下，HMGB1较基线的相对倍数升高（第14天/预处理前比值）仍是TA-TMA特有的独立预测因素。这表明虽然SOS中观察到一般性DAMP释放，但急剧的动力学激增对TA-TMA具有高度特异性。此外，本研究中确定为显著标志物的细胞外核蛋白代表潜在治疗靶点。细胞外H3和HMGB1作为细胞毒性DAMPs直接加重微血管内皮损伤。关于H3，肝素和非抗凝肝素类似物已被证明可结合并中和细胞外组蛋白，从而减轻组蛋白介导的细胞毒性同时维持基线止血。对于HMGB1，重组可溶性血栓调节蛋白（rTM）通过其N端结构域直接结合并螯合HMGB1，抑制下游炎症级联反应。尽管rTM在日本的临床可及性目前有限，但以肝素类似物或rTM靶向这些循环核蛋白代表了一种值得考虑的治疗严重内皮病（如TA-TMA）的策略。有趣的是，随后发生TA-TMA的患者在预处理基线和HSCT第0天时血清H3水平已显著高于对照组。鉴于H3水平与白细胞计数不相关，这些时间点的细胞外H3可能从被用于治疗基础疾病和预处理的细胞毒性药物损伤的正常组织细胞释放。由于TA-TMA通常在最后一次生物标志物测定后数周发生（中位发病第61天），观察到的HMGB1和H3升高可能代表明显疾病之前的亚临床内皮损伤。这种时间关系提示了早期风险识别和预防干预的潜在预测窗口；然而，需要通过延长纵向采样的前瞻性验证来确认这些生物标志物的临床效用。有趣的是，早期HMGB1动力学的预测性能因TA-TMA发病时间而异。当研究人员分析在初始28天研究期内发生TA-TMA的4例患者时，仅1例（25.0%）在第7天和第14天血浆HMGB1水平超过ROC衍生截断值，表明对超早期发病病例的预测价值有限。相比之下，在第28天后发生TA-TMA的患者（n=9）中，7例（77.8%）在第7天HMGB1水平高于截断值，7例（77.8%）在第14天也超过截断值。这一显著差异提示超早期和晚发性TA-TMA之间可能存在病理生理差异。晚发病例可能反映由持续DAMP介导的炎症驱动的进行性累积性内皮病，早期生物标志物激增有效捕获亚临床内皮损伤。相反，超早期病例可能由急性暴发性触发因素 precipitating，快速绕过早期生物标志物监测。这些发现强调在评估移植后微血管损伤早期预测生物标志物的效用时需考虑并发症发病时间。由于SOS和TA-TMA均以内皮损伤为核心病理生理特征，开发纳入HMGB1及其他内皮损伤标志物的预测模型可能大有裨益。此外，尽管样本量不足以进行多时间点的联合统计分析，构建序贯多标志物预测模型——例如将第14天早期HMGB1激增与随后第21天H3升高相结合——代表进一步提高TA-TMA预测准确性的有前景策略。如果未来研究进一步证实HMGB1与TA-TMA发生之间的关联，追求HMGB1靶向治疗TA-TMA将是非常理想的目标。研究局限性方面：第一，本研究为单中心前瞻性观察性研究，样本量相对较小。最终队列115例基于研究期间所有符合条件的知情同意且具有完整连续样本集的患者确定。115例的外部有效性有限，观察性设计固有的潜在选择偏差不能完全排除。第二，HMGB1测定使用仅供研究用的检测方法，因此在临床应用前必须实现检测标准化。第三，从TA-TMA诊断标准中排除可溶性C5b-9（sC5b-9）代表一项局限性。这是不可避免的，因为sC5b-9检测在日本临床实践中非常规可用。第四，虽然未进行正式的多重检验，但在不同时间点和标志物上进行了多次探索性ROC分析，因此不能排除偶然发现的可能性。此外，为保持统计严谨性并避免在这相对较小队列中因事后组合分析导致的潜在假阳性发现（I型错误），研究人员避免测试多标志物模型。独立外部验证队列也不可用。第五，包括基础疾病和预处理强度在内的背景异质性所致的潜在混杂仍是局限性。尽管卡方和Fisher精确检验显示有和无TA-TMA患者之间疾病风险无基线差异，多因素分析确认HMGB1指标为独立预测因子，但未测量的临床异质性仍可能影响结果。因此，需要在更大和更同质的患者队列中进行验证。最后，为基于本研究发现建立因果关系，需要通过更大队列的前瞻性多中心协作试验进行验证。结论部分：在这项探索性单中心研究中，研究人员的发现表明血清HMGB1可能从活化的白细胞释放，可作为TA-TMA的有用早期预测因子。鉴于样本量小及其他局限性，这些结果应视为初步的。需要更大规模的多中心研究来验证这些发现并阐明白细胞在TA-TMA发病机制中的作用，这可能有助于指导未来HMGB1靶向治疗策略。
